Identificação de Peptídeos de Pequenas Vesículas Extracelulares de Macrófagos Derivados da Medula Óssea
Summary
Este protocolo descreve um procedimento para isolar pequenas vesículas extracelulares de macrófagos por ultracentrifugação diferencial e extrair o peptidoma para identificação por espectrometria de massas.
Abstract
Pequenas vesículas extracelulares (EVs) são tipicamente secretadas pela exocitose de corpos multivesiculares (MVBs). Estas nanovesículas com um diâmetro de <200 nm estão presentes em vários fluidos corporais. Esses sEVs regulam vários processos biológicos, como transcrição e tradução de genes, proliferação e sobrevivência celular, imunidade e inflamação por meio de suas cargas, como proteínas, DNA, RNA e metabólitos. Atualmente, várias técnicas têm sido desenvolvidas para o isolamento de sEVs. Dentre eles, o método baseado em ultracentrifugação é considerado o padrão-ouro e é amplamente utilizado para o isolamento de sEVs. Os peptídeos são naturalmente biomacromoléculas com menos de 50 aminoácidos de comprimento. Esses peptídeos participam de uma variedade de processos biológicos com atividade biológica, como hormônios, neurotransmissores e fatores de crescimento celular. O peptidoma destina-se a analisar sistematicamente peptídeos endógenos em amostras biológicas específicas por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS). Aqui, introduzimos um protocolo para isolar sEVs por ultracentrifugação diferencial e extraímos peptidoma para identificação por LC-MS/MS. Este método identificou centenas de peptídeos derivados de sEVs de macrófagos derivados da medula óssea.
Introduction
Pequenas vesículas extracelulares (EVs) com diâmetro inferior a 200 nm estão presentes em quase todos os tipos de fluidos corporais e são secretadas por todos os tipos de células, incluindo urina, suor, lágrimas, líquido cefalorraquidiano e líquido amniótico1. Inicialmente, os sEVs foram considerados como recipientes para disposição de resíduos celulares, o que levou a pesquisas mínimas na década subsequente2. Recentemente, evidências crescentes indicam que os sEVs contêm proteínas específicas, lipídios, ácidos nucléicos e outros metabólitos. Essas moléculas são transportadas para as células-alvo3, contribuindo para a comunicação intercelular, por meio da qual participam de vários processos biológicos, como reparo tecidual, angiogênese, imunidade4 einflamação5,6, desenvolvimento tumoral e metástase7,8,9, etc.
Para facilitar o estudo de sEVs, é imperativo isolar sEVs de amostras complexas. Diferentes métodos de isolamento de sEVs foram desenvolvidos com base nas propriedades físicas e químicas de sEVs, tais como sua densidade, tamanho de partícula e proteínas marcadores de superfície. Essas técnicas incluem métodos baseados em ultracentrifugação, métodos baseados em tamanho de partículas, métodos baseados em captura de imunoafinidade, métodos baseados em precipitação de sEVs e métodos baseados em microfluídica10,11,12. Dentre essas técnicas, o método baseado em ultracentrifugação é amplamente reconhecido como o padrão-ouro para o isolamento de EVs e é a técnica mais comumente utilizada13.
Uma quantidade crescente de evidências sugere a presença de uma infinidade de peptídeos biologicamente ativos não descobertos nos peptidomas de vários organismos. Esses peptídeos contribuem significativamente para inúmeros processos fisiológicos, regulando o crescimento, o desenvolvimento, a resposta ao estresse 14,15 e a transdução de sinal16. O objetivo do peptidoma dos sEVs é descobrir os peptídeos transportados por esses sEVs e fornecer pistas sobre suas funções biológicas. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento de sEVs através de ultracentrifugação diferencial, seguido de extração de peptídeos desses sEVs para análise posterior de seu peptidoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao investigar a função de sEVs, é imperativo obter sEVs de alta pureza a partir de amostras biológicas complexas para evitar quaisquer contaminações potenciais. Uma variedade de métodos para o isolamento de sEVs tem sido desenvolvida13, e entre esses métodos, métodos baseados em ultracentrifugação diferencial têm mostrado pureza relativamente alta de sEVs. Neste estudo, 200 mL de sobrenadante celular foram coletados por 6 h, e cerca de 200-300 μg de sEVs foram obtidos por ultracentrif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado por bolsas da Fundação de Ciências Naturais da China (3157270). Agradecemos ao Dr. Feng Shao (Instituto Nacional de Ciências Biológicas, China) por fornecer o iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
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