זיהוי פפטידים של בועיות חוץ-תאיות קטנות ממקרופאגים שמקורם במח עצם
Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות ממקרופאגים על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וחילוץ הפפטידום לזיהוי באמצעות ספקטרומטריית מסות.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) מופרשות בדרך כלל על ידי אקסוציטוזה של גופים רב-תאיים (MVB). ננו-שלפוחיות אלה בקוטר של <200 ננומטר נמצאות בנוזלי גוף שונים. כלי רכב חשמליים אלה מווסתים תהליכים ביולוגיים שונים כגון שעתוק ותרגום גנים, התרבות תאים והישרדותם, חסינות ודלקת באמצעות מטעניהם, כגון חלבונים, דנ"א, רנ"א ומטבוליטים. נכון לעכשיו, פותחו טכניקות שונות לבידוד sEVs. ביניהם, השיטה מבוססת אולטרה-צנטריפוגה נחשבת לתקן הזהב ונמצאת בשימוש נרחב לבידוד כלי רכב חשמליים. הפפטידים הם ביו-מקרומולקולות טבעיות עם אורך של פחות מ-50 חומצות אמינו. פפטידים אלה משתתפים במגוון תהליכים ביולוגיים בעלי פעילות ביולוגית, כגון הורמונים, מוליכים עצביים וגורמי גדילה של תאים. הפפטידום נועד לנתח באופן שיטתי פפטידים אנדוגניים בדגימות ביולוגיות ספציפיות על ידי ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית (LC-MS/MS). כאן, הצגנו פרוטוקול לבידוד sEV על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית ופפטידום מופק לזיהוי על ידי LC-MS/MS. שיטה זו זיהתה מאות פפטידים שמקורם ב-sEV ממקרופאגים שמקורם במח עצם.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) בקוטר של פחות מ-200 ננומטר נמצאות כמעט בכל סוגי נוזלי הגוף ומופרשות על ידי כל סוגי התאים, כולל שתן, זיעה, דמעות, נוזל מוחי ושדרתי ומי שפיר1. בתחילה, כלי רכב חשמליים נחשבו ככלי קיבול לסילוק פסולת סלולרית, מה שהוביל למחקר מינימלי בעשור שלאחר מכן2. לאחרונה, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שכלי רכב חשמליים מכילים חלבונים ספציפיים, שומנים, חומצות גרעין ומטבוליטים אחרים. מולקולות אלה מועברות לתאי מטרה3, התורמות לתקשורת בין-תאית, באמצעותה הן משתתפות בתהליכים ביולוגיים שונים, כגון תיקון רקמות, אנגיוגנזה, חסינות4 ודלקת5,6, התפתחות גידולים וגרורות 7,8,9 ועוד.
כדי להקל על המחקר של sEVs, זה הכרחי לבודד sEV מדגימות מורכבות. שיטות בידוד שונות של כלי רכב חשמליים פותחו בהתבסס על התכונות הפיזיקליות והכימיות של כלי רכב חשמליים, כגון צפיפותם, גודל החלקיקים וחלבוני סמן פני השטח. טכניקות אלה כוללות שיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה, שיטות מבוססות גודל חלקיקים, שיטות מבוססות לכידת זיקה חיסונית, שיטות מבוססות משקעים של sEVs ושיטות מבוססות מיקרופלואידיקה10,11,12. בין טכניקות אלה, השיטה המבוססת על אולטרה-צנטריפוגה מוכרת באופן נרחב כתקן הזהב לבידוד כלי רכב חשמליים והיא הטכניקה הנפוצה ביותר13.
כמות הולכת וגדלה של ראיות מצביעה על נוכחותם של מספר רב של פפטידים פעילים ביולוגית שלא התגלו בפפטידומים של אורגניזמים שונים. פפטידים אלה תורמים באופן משמעותי לתהליכים פיזיולוגיים רבים על ידי ויסות גדילה, התפתחות, תגובת לחץ 14,15 והעברת אותות16. המטרה של הפפטידום של sEV היא לחשוף את הפפטידים הנישאים על ידי sEV אלה ולספק רמזים לתפקודים הביולוגיים שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול של בידוד sEV באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, ואחריו חילוץ של פפטידים מכלי רכב חשמליים אלה לניתוח נוסף של הפפטידום שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאשר חוקרים את תפקודם של כלי רכב חשמליים, הכרחי להשיג sEV בעלי טוהר גבוה מדגימות ביולוגיות מורכבות כדי למנוע זיהומים פוטנציאליים. 13 פותחו מגוון שיטות לבידוד כלי רכב חשמליים, ובין השיטות הללו, שיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית הראו טוהר גבוה יחסית של כלי רכב חשמליים. ב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של סין (3157270). אנו מודים לד”ר פנג שאו (המכון הלאומי למדעי הביולוגיה, סין) על מתן iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
