Identificatie van peptiden van kleine extracellulaire blaasjes uit van beenmerg afgeleide macrofagen
Summary
Dit protocol beschrijft een procedure om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van macrofagen door differentiële ultracentrifugatie en het peptidoom te extraheren voor identificatie door massaspectrometrie.
Abstract
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV’s) worden meestal uitgescheiden door de exocytose van multivesiculaire lichamen (MVB’s). Deze nanovesicles met een diameter van <200 nm zijn aanwezig in verschillende lichaamsvloeistoffen. Deze sEV's reguleren verschillende biologische processen zoals gentranscriptie en -translatie, celproliferatie en -overleving, immuniteit en ontsteking door hun ladingen, zoals eiwitten, DNA, RNA en metabolieten. Momenteel zijn er verschillende technieken ontwikkeld voor sEV's isolatie. Onder hen wordt de op ultracentrifugatie gebaseerde methode beschouwd als de gouden standaard en wordt veel gebruikt voor sEV-isolatie. De peptiden zijn van nature biomacromoleculen met minder dan 50 aminozuren lang. Deze peptiden nemen deel aan een verscheidenheid aan biologische processen met biologische activiteit, zoals hormonen, neurotransmitters en celgroeifactoren. Het peptidoom is bedoeld om endogene peptiden in specifieke biologische monsters systematisch te analyseren door middel van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Hier introduceerden we een protocol om sEV's te isoleren door differentiële ultracentrifugatie en geëxtraheerde peptidome voor identificatie door LC-MS / MS. Deze methode identificeerde honderden van sEV's afgeleide peptiden uit van beenmerg afgeleide macrofagen.
Introduction
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV’s) met een diameter van minder dan 200 nm zijn aanwezig in bijna alle soorten lichaamsvloeistoffen en worden uitgescheiden door allerlei soorten cellen, waaronder urine, zweet, tranen, hersenvocht en vruchtwater1. Aanvankelijk werden sEV’s beschouwd als recipiënten voor het verwijderen van cellulair afval, wat leidde tot minimaal onderzoek in het daaropvolgende decennium2. Onlangs is er steeds meer bewijs dat sEV’s specifieke eiwitten, lipiden, nucleïnezuren en andere metabolieten bevatten. Deze moleculen worden getransporteerd naar doelcellen3 en dragen bij aan intercellulaire communicatie, waardoor ze deelnemen aan verschillende biologische processen, zoals weefselherstel, angiogenese, immuniteit4 en ontsteking5,6, tumorontwikkeling en metastase 7,8,9, enz.
Om de studie van sEV’s te vergemakkelijken, is het noodzakelijk om sEV’s te isoleren van complexe monsters. Verschillende sEV’s isolatiemethoden zijn ontwikkeld op basis van de fysische en chemische eigenschappen van sEV’s, zoals hun dichtheid, deeltjesgrootte en oppervlaktemarkereiwitten. Deze technieken omvatten op ultracentrifugatie gebaseerde methoden, op deeltjesgrootte gebaseerde methoden, op immunoaffiniteitsafvang, op sEV’s gebaseerde neerslagmethoden en op microfluïdica gebaseerde methoden10,11,12. Onder deze technieken wordt de op ultracentrifugatie gebaseerde methode algemeen erkend als de gouden standaard voor sEV-isolatie en is de meest gebruikte techniek13.
Een toenemende hoeveelheid bewijs suggereert de aanwezigheid van een groot aantal onontdekte biologisch actieve peptiden in de peptidomen van verschillende organismen. Deze peptiden dragen aanzienlijk bij aan tal van fysiologische processen door groei, ontwikkeling, stressrespons 14,15 en signaaltransductie16 te reguleren. Het doel van het peptidoom van sEV’s is om de peptiden te ontdekken die door deze sEV’s worden gedragen en aanwijzingen te geven voor hun biologische functies. Hier presenteren we een protocol van het isoleren van sEV’s door differentiële ultracentrifugatie, gevolgd door extractie van peptiden uit deze sEV’s voor verdere analyse van hun peptidoom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij het onderzoeken van de functie van sEV’s is het noodzakelijk om zeer zuivere sEV’s te verkrijgen uit complexe biologische monsters om mogelijke verontreinigingen te voorkomen. Er zijn verschillende methoden voor sEV-isolatie ontwikkeld13, en van deze methoden hebben differentiële ultracentrifugatie-gebaseerde methoden een relatief hoge zuiverheid van sEV’s aangetoond. In deze studie werd 200 ml celsupernatant gedurende 6 uur verzameld en ongeveer 200-300 μg sEV’s werden verkregen door differ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Natural Science Foundation of China (3157270). We danken Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) voor het verstrekken van iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
