Identifizierung von Peptiden kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen aus dem Knochenmark
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen durch differentielle Ultrazentrifugation und Extraktion des Peptidoms zur Identifizierung mittels Massenspektrometrie.
Abstract
Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) werden typischerweise durch die Exozytose von multivesikulären Körpern (MVBs) sezerniert. Diese Nanovesikel mit einem Durchmesser von <200 nm sind in verschiedenen Körperflüssigkeiten vorhanden. Diese sEVs regulieren verschiedene biologische Prozesse wie Gentranskription und -translation, Zellproliferation und -überleben, Immunität und Entzündung durch ihre Ladungen wie Proteine, DNA, RNA und Metaboliten. Derzeit wurden verschiedene Techniken zur Isolierung von Elektrofahrzeugen entwickelt. Unter ihnen gilt die auf Ultrazentrifugation basierende Methode als Goldstandard und wird häufig für die Isolierung von Elektrofahrzeugen eingesetzt. Bei den Peptiden handelt es sich um natürliche Biomakromoleküle mit einer Länge von weniger als 50 Aminosäuren. Diese Peptide sind an einer Vielzahl biologischer Prozesse mit biologischer Aktivität beteiligt, wie z. B. Hormone, Neurotransmitter und Zellwachstumsfaktoren. Das Peptidom soll körpereigene Peptide in spezifischen biologischen Proben mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) systematisch analysieren. Hier haben wir ein Protokoll zur Isolierung von sEVs durch differentielle Ultrazentrifugation und extrahiertes Peptidom zur Identifizierung mittels LC-MS/MS eingeführt. Diese Methode identifizierte Hunderte von sEVs-abgeleiteten Peptiden aus aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen.
Introduction
Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm sind in fast allen Arten von Körperflüssigkeiten vorhanden und werden von allen Arten von Zellen sezerniert, einschließlich Urin, Schweiß, Tränen, Liquor cerebrospinalis und Fruchtwasser1. Ursprünglich wurden sEVs als Behälter für die Entsorgung von zellulärem Abfall in Betracht gezogen, was im folgenden Jahrzehnt zu minimaler Forschung führte2. In jüngster Zeit gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass sEVs spezifische Proteine, Lipide, Nukleinsäuren und andere Metaboliten enthalten. Diese Moleküle werden zu den Zielzellen3 transportiert und tragen zur interzellulären Kommunikation bei, durch die sie an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, wie z. B. Gewebereparatur, Angiogenese, Immunität4 und Entzündung 5,6, Tumorentwicklung und Metastasierung 7,8,9 usw.
Um die Untersuchung von sEVs zu erleichtern, ist es unerlässlich, sEVs aus komplexen Proben zu isolieren. Basierend auf den physikalischen und chemischen Eigenschaften von sEVs, wie z. B. ihrer Dichte, Partikelgröße und Oberflächenmarkerproteinen, wurden verschiedene Methoden zur Isolierung von sEVs entwickelt. Zu diesen Techniken gehören auf Ultrazentrifugation basierende Methoden, partikelgrößenbasierte Methoden, auf Immunaffinitätsabscheidung basierende Methoden, sEVs-fällungsbasierte Methoden und mikrofluidikbasierte Methoden10,11,12. Unter diesen Techniken ist die auf Ultrazentrifugation basierende Methode weithin als Goldstandard für die Isolierung von sEVs anerkannt und die am häufigsten verwendete Technik13.
Immer mehr Hinweise deuten auf das Vorhandensein einer Vielzahl unentdeckter biologisch aktiver Peptide in den Peptidomen verschiedener Organismen hin. Diese Peptide tragen maßgeblich zu zahlreichen physiologischen Prozessen bei, indem sie Wachstum, Entwicklung, Stressreaktion 14,15 und Signaltransduktion16 regulieren. Das Ziel des Peptidoms von sEVs ist es, die von diesen sEVs getragenen Peptide aufzudecken und Hinweise auf ihre biologischen Funktionen zu geben. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von sEVs durch differentielle Ultrazentrifugation vor, gefolgt von der Extraktion von Peptiden aus diesen sEVs zur weiteren Analyse ihres Peptidoms.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei der Untersuchung der Funktion von sEVs ist es unerlässlich, hochreine sEVs aus komplexen biologischen Proben zu gewinnen, um mögliche Kontaminationen zu vermeiden. Es wurde eine Vielzahl von Methoden zur Isolierung von sEVs entwickelt13, und unter diesen Methoden haben auf differentieller Ultrazentrifugation basierende Methoden eine relativ hohe Reinheit von sEVs gezeigt. In dieser Studie wurden 200 ml Zellüberstand für 6 h gesammelt und etwa 200-300 μg sEVs wurden durch differentielle Ul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Natural Science Foundation of China (3157270) unterstützt. Wir danken Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) für die Bereitstellung von iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
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