涙液のバイオシェディング研究におけるアデノ随伴ウイルスベクターの検出のための検証可能な液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応アッセイ

1. 合成DNA断片の調製 品質管理として使用するために、標的増幅領域を含む合成DNA断片を設計して注文します。配列に、目的の標的遺伝子のフォワードプライマーからリバースプライマーまでのアンプリコン配列全体が含まれ、各プライマー結合配列の5’末端に4〜6塩基対の配列が延長されていることを確認します。 12塩基対を超えるアデニンおよびチミンのホモポリマー、または8塩基対を超えるグアニンおよびシトシン塩基対のホモポリマーは、ホモポリマーが遺伝子断片の合成を妨げる可能性があるため避けてください。注:アンプリコンにそのような配列が含まれている場合、プライマーおよびプローブのアニーリング部位が維持されている限り、塩基置換を行うことができます。 あるいは、典型的なクローニング戦略を用いてアンプリコンを含む直鎖化プラスミドを調製します。 合成DNA断片を含むチューブをマイクロ遠心分離機で~10秒間遠心分離し、材料がチューブの底に集められるようにします。 tris-EDTA(TE)バッファーを使用して合成DNA断片を1.0 ×10 10 コピー/μLの濃度に、またはターゲットアッセイ範囲に基づいて適切に再懸濁します。 短時間ボルテックスした後、50°Cで20±5分間インキュベートします。氷の上で冷やす。 複数の、理想的には使い捨てのアリコートを準備し、使用するまで-70〜-90°Cで保存します。注:この方法で調製された合成DNA断片は、通常、再懸濁日から少なくとも24ヶ月間安定です。 必要に応じて、品質管理として使用する前に調製した合成DNAストックの正確な濃度を決定するか、使用する再懸濁液に基づいて公称濃度を推定します。 2. プライマーとプローブの調製 典型的な設計戦略26、27を使用して所望の増幅領域を標的とするプライマーおよび加水分解プローブを設計および注文する。ddPCRシステムと互換性のある5’蛍光レポーター色素(FAMなど)と3’クエンチャー(アイオワブラックダーククエンチャーなど)を利用します。注:多数のPCRアッセイデザインソフトウェアパッケージが存在し、どれでも利用できます。例えば、国立バイオテクノロジー情報センター28 によるPrimer-BLASTは、アッセイ設計のための堅牢なオプションと、可能性のあるオフターゲット効果を特定するために特異性をバイオインフォマティックに評価することが容易であるため、広く使用されています。プライマーおよびプローブの調製は、それらが供給される形式に応じて、ここに列挙されたステップとは異なる場合があることに留意されたい。 フォワードプライマー、リバースプライマー、プローブを含むチューブをマイクロ遠心分離機で~10秒間遠心分離し、材料をチューブの底までペレット化します。 TE バッファーを使用してプライマーを 20 μM に再懸濁します。簡単に渦。 TE バッファーを使用してプローブを 10 μM に再懸濁します。簡単に渦。 複数の理想的には使い捨てのアリコートを準備し、使用するまで最低-20°Cで保管してください。注:この方法で調製されたプライマーおよびプローブは、通常、再懸濁日から少なくとも24ヶ月間安定です。 3. サンプル希釈バッファーの調製 PCRバッファーと剪断したサケ精子DNAを室温で解凍する。徹底的に渦をかけて混ぜます。 表1に従ってサンプル希釈バッファーを調製します。 徹底的に渦。調製後2〜8°Cで最大1か月間保管してください。 表1:サンプル希釈バッファーの調製。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 4.マスターミックスの調製 プローブ、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブ用のddPCRマスターミックスを室温で解凍し、使用前に解凍後少なくとも10分間温めます。使用するまで室温で保管してください。注:これらの試薬は、効率的な液滴形成を確実にするために、完全に室温にする必要があります。調製中は試薬を氷の上に置かないでください。ボルテックスは、使用前にミニ遠心分離機で徹底的にそして短時間遠心分離する。注意: 制限酵素は通常グリセロールで供給され、使用直前に保管場所から取り除く必要があります。穏やかに混ぜる。渦巻かないでください。 各増幅ターゲットのPCRマスターミックスを調製します。推奨されるPCRマスターミックス組成については 表2 を参照し、必要に応じてプライマーとプローブの濃度を変更します。制限酵素を添加する前に十分にボルテックスおよび短時間遠心分離する。制限酵素を加え、反転させて混ぜます。注:このステップでは、液滴形成後の最終容量40 μLのPCR反応(15 μLのPCRマスターミックス、5.0 μLのテンプレート、および20 μLの液滴生成オイルで構成される)を得るために、22 μLのPCR反応が必要です。 プレートマップに従って、16.5 μLのマスターミックスを各ウェルに追加します。検証精度と精度実行のプレートマップの例については、 図1 を参照してください。プレートに、品質管理(QC)シリーズの3つの独立した調製物、テストされた3つの独立してテストされた内因性涙液アリコート、高レベルと低レベルにスパイクされ、スパイクされていない、および3つの独立したテンプレートなしコントロール(NTC)が含まれていることを確認します。 プレート全体でこれらのウェルのレイアウトを変更し、セット1を濃度の高い順にロードし、セット2を濃度の高い順にロードし、セット3をランダムな順序でロードして、プレートの位置固有の効果があるかどうかを評価します。 サンプルを配列して、できるだけ多くのカラムを満たし、カラム内の未使用のウェルをコントロールバッファーで満たします。必要に応じて、複数の内因性コントロールロット(例えば、より多くの涙のプールまたは個人から収集された涙)を残りのウェルに含めます。 透明な粘着フィルムでプレートをシールします。テンプレートの準備中は、プレートを室温で保持します。または、プレートを4〜2°Cで最大8時間保持しますが、テンプレートを追加する前に少なくとも10分間室温に戻します。 表2:PCRマスターミックス調製例。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 図1:検証精度と精密実行のプレートマップの例。 略語:ULQC =上限品質管理;HQC = 高品質管理;MQC = 中程度の品質管理;LQC = 低品質管理;LLQC = 品質管理の下限;NTC = テンプレート コントロールなし。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 5. 品質管理の準備 合成DNA断片または直鎖状プラスミドを室温で解凍し、使用前に解凍後少なくとも10分間温めます。テンプレートを室温にして、効率的な液滴形成を確保します。使用するまで室温で保管してください。ボルテックスは、使用前にミニ遠心分離機で徹底的にそして短時間遠心分離する。 サンプル希釈バッファーを希釈液として使用してQC希釈液を調製します。検証精度と精度の実行を準備するための推奨濃度の例を 表3に示します。注意: 精度と精度の実行が正常に完了した後、各プレートで高品質制御(HQC)、中品質制御(MQC)、および低品質管理(LQC)のみを実行する必要があります。精度と精度のために、アッセイ内の精度と精度を評価するために、QCの少なくとも3つの独立した希釈が含まれています。精度と精度の実行に続いて、1つの希釈シリーズのみを含める必要があります。 調製後、希釈液をプレートに添加するまで室温で保存する。 希釈液を氷上または必要に応じて2〜8°Cで保管します。その後の使用の前に、希釈液を使用前に少なくとも10分間室温に温めてください。.一日の終わりにQCを破棄します。 表3:合成二本鎖DNA断片を用いた品質管理(QC)調製例。 略語:ULQC =上限品質管理;HQC = 高品質管理;MQC = 中程度の品質管理;LQC = 低品質管理;LLQC = 品質管理の下限;NTC = テンプレート コントロールなし。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 6. サンプルの調製 臨床試験から収集した涙液サンプルを室温で解凍するまで解凍し、使用前に解凍後少なくとも10分間温めます。使用するまで室温で保管してください。ボルテックスは、使用前にマイクロ遠心分離機で徹底的かつ短時間遠心分離します。 サンプル希釈バッファーを希釈液として使用して、涙液サンプルを 1:10 (またはそれ以上) に希釈して、0.2 mL の PCR チューブまたは 8 ウェル PCR ストリップにします。チューブを密封します。注:涙液中のターゲットの予想される濃度によっては、サンプルをさらに希釈するか、各サンプルの複数の希釈をテストする必要がある場合があります。 サンプルをサーマルサイクラーで95°Cで10分間加熱した後、4°Cで5分以上保持して冷却します。3°C/sのランプレートを使用してください。注意: サンプルは、同じ日に使用するまで4°Cでサーマルサイクラーに留まるか、-70〜-90°Cで凍結して長期間保管することができます。このステップは、ベクターキャプシドを変性させ、ゲノムを放出する役割を果たす。QC合成DNAフラグメントまたは直鎖化プラスミドは二本鎖であるため、この加熱ステップを経ないでください。 冷却後のサンプルを室温に戻し(または凍結した場合は室温で解凍)、少なくとも10分間温めます。注:効率的な液滴形成を確実にするために、サンプルを完全に室温にする必要があります。 7. テンプレートの追加 マスターミックスを含むddPCRプレートを取り出します。各サンプルまたはQC希釈管を徹底的に短時間遠心分離してボルテックスし、材料を回収します。 接着フィルムをはがし、プレートマップに従って、5.5 μLのQCまたはサンプルを96ウェルプレートの適切なウェルに加えます。メモ: 必要なボリュームの説明については、手順 4.2.1 を参照してください 5.5 μLのサンプル希釈バッファーをNTCウェルに追加します。 液滴生成には、カラムのすべてのウェルに反応制御または緩衝制御が必要です。カラムのウェルにサンプル反応が含まれていない場合は、ヌクレアーゼフリー水を使用して 2x ddPCR バッファーコントロールを 1:2 に希釈します。22 μL の 1x ddPCR バッファーコントロールをカラムの空のウェルに追加します。注: カラム全体を使用しない場合は、これらのウェルにバッファー制御を追加する必要はありません。 プレートに穴を開け可能なホイルシールを追加します。プレートをプレートシーラーに入れ、180°Cで5秒間シールします。または、ddPCRシステムメーカーの推奨に従ってプレートをシールします。 プレートを最高速度で少なくとも30秒間渦流し(連続渦渦設定を使用、タッチボルテックスは使用しないでください)、プレートスピナーで短時間遠心分離します。注:このステップでのプレートの完全かつ完全な混合は、PCR反応を液滴に適切に分割するために重要です。ウェル内に気泡が見えないことを確認してください。必要に応じて、液滴生成前にプレートを2〜8°Cで最大4時間保持することができます。保持されている場合は、液滴を生成する前に、プレートを最低10分間室温に戻します。 8.自動液滴生成、熱サイクル、および液滴読み取り 次のように自動液滴発生器で液滴を生成します。タッチスクリーンで、サンプルを含むプレートマップ上の列を選択します。機器のデッキが点灯し、必要な消耗品(DG32カートリッジ、チップ、廃棄物容器、液滴生成オイル)を示します。黄色のライトは消耗品を追加する必要があることを示し、緑色のライトは十分な消耗品があることを示します。 液滴発生器を後ろから前にロードします。 加水分解プローブの場合は、プローブ用の液滴生成オイルが取り付けられ、ウェル数に対して十分なオイルが残っていることを確認してください。代替PCR化学物質を使用する場合は、互換性のある液滴生成オイルが取り付けられていることを確認してください。 液滴プレートホルダーにコールドブロックを置きます。ブロックが完全に青色で、ピンクが見えないことを確認します。新しい 96 ウェル ddPCR プレートをコールドブロックに入れます。 準備したPCRプレートをサンプルプレートホルダーに入れます。機械の蓋を閉めます。液滴生成のために 開始 を押します。 液滴形成後、反応あたり合計40 μLが新しいPCRプレートに自動的に移されます。 液滴生成が完了してから30分以内に、液滴を含むプレートをコールドブロックから取り出します。この段階で液滴が最も壊れやすいので、穏やかに作業してください。 プレートに穴を開け可能なホイルシールを追加します。プレートをプレートシーラーに入れ、180°Cで5秒間シールします。または、ddPCRシステムメーカーの推奨に従ってプレートをシールします。 プレートを互換性のあるサーマルサイクラーに置きます。サイクリング条件を入力します( 表4を参照)。 サーマルサイクルの終了後、プレートをサーマルサイクラーに保持し、2〜8°Cに移すか、すぐに読み取ります。注意: プレートを12〜4°Cで12時間保持すると、液滴数が改善される可能性がありますが、これは必須ではありません。ホールドなしで十分な液滴が得られるはずです。 プレートを液滴リーダーにロードし、十分なリーダーオイルが残り、廃棄物容器に十分なスペースがあることを確認します。液滴を読み取ります。熱サイクル開始から24時間以内に液滴の読み取りを実行します。 表4:典型的な熱サイクル条件。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 9.データ分析 注:ポアソン統計量を使用して濃度を適切に計算するには、ウェルあたり最低10,000液滴が必要です。液滴が10,000個未満のウェルでは分析を試みないでください。 液滴を正または負として定義するには、しきい値が必要です。ddPCR分析ソフトウェアは、ウェル間で異なる可能性のある閾値を自動的に適用します。ただし、プレートのすべてのウェルのしきい値をNTCウェルの蛍光強度よりわずかに高く設定すると、より一貫性があり、正確で、正確な結果が得られます。注:しきい値を適切に配置するには、正と負の液滴の分離と液滴雨の存在量に応じて最適化が必要になる場合があります( 図2を参照)。この例では、液滴振幅グラフは、各QCレベルおよびNTCにおけるウェルの例を示している。紫色の線は、負の液滴集団よりわずかに上に設定された1,000のしきい値を示します。 ポアソン統計モデリングでは、95%の信頼度で濃度を計算するために、少なくとも3つの正の液滴が必要です。ゼロ、1、または2つの正の液滴を含むすべてのウェルを陰性と見なし、ゼロ27の濃度に設定します。 各涙サンプルのコピー数を逆算します。濃度(コピー/μL)は、データレポートに記載されています。この値を使用して、元のサンプル(つまり、涙液サンプル)のコピー/ μLで濃度を決定します。 ddPCR反応希釈率を計算するには、液滴形成前の初期PCR反応量を添加したテンプレートの体積で割ります。このメソッドで示されたボリュームを使用すると、値は 4 になります。 元のサンプルから段階希釈係数を決定します(ステップ6.2)。 サンプル中のコピー/μLを決定するには、コピー/μLにddPCR反応希釈を掛け、次に段階希釈係数を掛けます。たとえば、データレポートで生成されたコピー/μLの濃度は966でした。反応液22 μLあたり5.5 μLのテンプレートを添加しました。サンプルの1:50,000段階希釈を利用しました。 同じサンプルの複数の希釈がテストされた場合は、すべての有効な範囲内の希釈を分析し、平均を計算します。 各QCについて、所定のQC希釈液の濃度(コピー/μL)をddPCR反応量(20 μL)で割ることにより、予想されるコピー/μL PCR反応を計算します。これにより、この公称値を、追加の計算なしでデータレポートで提供されるコピー/μL値と直接比較できます。注:このアプローチは、代表的な結果で利用されたスパイク涙液サンプルの分析にも使用されました。 レプリケートウェルを使用して、平均値、標準偏差、変動係数(%CV)、およびサンプルの公称濃度(%RE)に対する相対誤差の割合(%RE)またはQC値を決定します(該当する場合は複数の希釈液を含めます)。ウェル間精度の評価では、ウェルの重複(含まれている場合)ごとにこれを決定します。 アッセイ内の精度と精度を評価するには、バッチ内で使用する希釈シリーズまたはアリコートごとにこれを決定します。 アッセイ間の精度と精度を評価するには、含まれている各バッチのアッセイ内平均を使用してこれを決定します。 図2:しきい値の設定例 略語:ULQC =上限品質管理;HQC = 高品質管理;MQC = 中程度の品質管理;LQC = 低品質管理;LLQC = 品質管理の下限;NTC = テンプレート コントロールなし。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 10.アッセイの合格基準 各バッチの計算データに次の仕様を使用して、バッチが許容可能かどうかを判断します。これらの条件が満たされない場合は、バッチを無効にして繰り返します。注:これらの基準は、PCRベースのアッセイバリデーション18、19、20、21、22、23、24、25に関する公開されたホワイトペーパーからのコンセンサスとして決定されました。臨床応用に応じてターゲット基準を変更する必要があるかもしれません。 テンプレート コントロールなし (NTC)各NTCウェルに少なくとも10,000個の液滴があることを確認します。 各NTCウェルの正の液滴が3つ未満であることを確認します。 QC およびアッセイ範囲各QCウェルに少なくとも10,000個の液滴があることを確認します。 QC濃度の複製ウェルの精度が≤25.0%CVであることを確認してください(定量の上限と下限を除いて、≤30.0%が許容範囲です)。これをQCセットと濃度レベルごとに個別に評価します。 各平均QCレベルでの逆算濃度の相対誤差が、±30.0%REが許容される定量の上限と下限を除いて、公称濃度(コピー/PCR反応)の±25.0%RE以内であることを確認してください。これをQCセットと濃度レベルごとに個別に評価します。 QCサンプルの少なくとも2/3(たとえば、6つの結果のうち4つ)および各レベル(低、中、高)のQCサンプルの50%がこれらのガイドラインを満たしていることを確認してください。 サンプル分析するサンプルウェルに少なくとも10,000個の液滴があることを確認してください。 分析するサンプル希釈液の複製ウェルの精度が≤25.0%CVであることを確認してください。 所定のサンプルの少なくとも1つの含まれる希釈液が、上限および下限QCに基づいて上記で定義されたアッセイの定義された定量範囲内にあることを確認してください。 含まれるすべての希釈液で定義された定量上限を超える結果が得られ、十分なサンプル量が残っている場合は、サンプルのより高い希釈率を使用してアッセイを繰り返します。 含まれるすべての希釈液で定量下限よりも低い結果が得られ、十分なサンプル量が残っている場合は、サンプルの下限希釈率を使用してアッセイを繰り返します。注:3つ以上の陽性液滴を含むが、濃度が定量下限を下回るサンプルは、検出可能と説明できますが、定量化できません。