Gözyaşlarının Biyodökülme Çalışmalarında Adeno-İlişkili Viral Vektörlerin Tespiti için Doğrulanabilir Bir Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi
Summary
Burada, gen tedavisi vektörlerinin klinik gelişimini desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu ile insan gözyaşlarında adeno ilişkili viral vektörlerin uyumlu tespitinde iyi laboratuvar uygulamalarının geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Genetik hastalıkları tedavi etmek için viral vektörlerin kullanımı son yıllarda önemli ölçüde artmıştır ve bugüne kadar kaydedilen 2.000’den fazla çalışma bulunmaktadır. Adeno ilişkili viral (AAV) vektörler, voretigene neparvovec-rzyl’in onaylanmasıyla örneklendiği gibi, gözle ilgili hastalıkların tedavisinde özel bir başarı elde etmişlerdir. Piyasaya yeni tedaviler getirmek için, düzenleyici kurumlar tipik olarak vektörün çevreye salınımını değerlendirmek için nitelikli veya doğrulanmış biyodökülme çalışmaları talep eder. Bununla birlikte, bu tür dökülme çalışmalarını desteklemek için moleküler tabanlı testlerin geliştirilmesi için Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından resmi bir kılavuz yayınlanmamıştır ve geliştiricileri kendileri için en iyi uygulamaları belirlemeye bırakmıştır. Bu protokolün amacı, klinik biyoshedding çalışmalarını desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR) ile insan gözyaşlarında AAV vektörlerinin saptanması için doğrulanabilir bir protokol sunmaktır. Bu makale, moleküler tahlil validasyonuna yönelik mevcut endüstri yaklaşımlarını tartışmakta ve yöntemin şu anda beyaz kağıtlarda önerilen hedef tahlil kabul kriterlerini aştığını göstermektedir. Son olarak, uygulamadan bağımsız olarak herhangi bir ddPCR testinin performansında kritik olan adımlar tartışılmaktadır.
Introduction
Gen terapisi tanımları değişir, ancak genellikle bir genin ekspresyonunu değiştirmek veya manipüle etmek veya bir canlı hücrenin biyolojik özelliklerini klinik bir amaç için değiştirmek için hücresel genomun belirli bir DNA dizisinin kasıtlı ve sıklıkla beklenen kalıcı bir değişimini indükler 1,2. Viral vektörler, transdüksiyon etkinlikleri nedeniyle gen terapisi için giderek daha fazla araç olarak kullanılmaktadır; bir rapor, mevcut gen terapisi klinik çalışmalarının% 70’inden fazlasının viral vektörleri kullandığını göstermektedir3. Gen tedavisi için viral vektörlere olan ilgi giderek artmaktadır. Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği’nin Gen, Hücre ve RNA terapisi manzarasına ilişkin 4. Çeyrek 2022 Üç Aylık Veri Raporu, 2022 yılında, klinik öncesinden ön kayda kadar gen, hücre ve RNA terapisi boru hattının% 7 oranında arttığını ve geliştirilmekte olan toplam tedavi sayısını 3.726’ya çıkardığını ve bunların 2.053’ünün (% 55) gen terapileri olduğunu bildirmiştir4. Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi (ABD FDA) şu anda insanlarda klinik kullanım için 27 hücre ve gen terapisini onaylamıştır, bunlardan beşi özellikle viral vektörleri kullanmaktadır5.
Adeno ilişkili virüsler (AAV’ler) gen terapisi için araçlar olarak özel ilgi görmüştür. Yakın tarihli bir meta-analiz, son yirmi yılda AAV’lerin kullanımını araştıran yaklaşık 136 klinik çalışma olduğunu ortaya koymuştur6. Ek olarak, ABD FDA onaylı beş gen terapisinden üçü AAV tabanlıdır. Bunun nedeni, yüksek oranda düzenlenebilir doğaları, spesifik doğal olarak oluşan veya yapay olarak tasarlanmış vektörlerin kullanımına göre ayarlanabilen geniş konak aralığı, insanlarda düşük patojenite ve toksisite ve genellikle düşük immünojenite 7,8’dir. AAV’ler ayrıca onaylanmış bir klinik ortamda oküler hastalıkları tedavi etmek için başarıyla kullanılmıştır. Voretigene neparvovec-rzyl, bialelik RPE65 mutasyonuyla ilişkili retina distrofisi9’u tedavi etmek için 2017 yılında ABD FDA ve 2018 yılında Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onaylanan AAV2 tabanlı bir tedavidir.
AAV tabanlı tedavilerin geliştirilmesine olan ilginin artmasıyla birlikte, tahliller konusunda düzenleyici rehberliğe ihtiyaç duyulmaktadır. Herhangi bir viral vektörün doğru tespiti ve miktarının belirlenmesi, ürün geliştirmenin keşif, üretim ve klinik öncesi/klinik test aşamalarının ayrılmaz bir parçasıdır. ABD FDA, insan gen terapisi için kimya, üretim ve kontrol araştırma yeni ilaç uygulamaları 10, gen terapisinin uygulanmasından sonra uzun süreli takip11, replikasyon yetkin retrovirüs testi 12 ve gen terapilerinde kullanılan mikrobiyal vektörler için öneriler13 dahil olmak üzere gen terapileri için bazı kılavuzlar yayınlamaya başlamıştır. EMA ayrıca, genel olarak FDA önerileriyle uyumlu olan gen terapisi ürünlerinin geliştirilmesine ilişkin bir dizi kılavuz yayınlamıştır, ancak bazı farklılıklar vardır14. Bu kılavuzların, belirli düzenlemelere atıfta bulunulan durumlar dışında, yasal olarak uygulanabilir sorumluluklar oluşturmamasına rağmen, düzenleyici kurumların konuyla ilgili mevcut düşünceleri ve ilaç başvuruları ve düzenleyici onay için gerekli tahliller için beklentileri hakkında netlik sağladıklarını belirtmek önemlidir.
FDA, özellikle oküler ve oküler olmayan dokuları, göz içi sıvılarını ve kanı hedeflemek için bir vektörün uygulama bölgesinden dağılımını, kalıcılığını ve klirensini değerlendirmek için çalışmaların yapılmasını önermektedir15. Bunlar biyodağılım ve dökülme çalışmaları şeklini alır. Biyodağıtım çalışmaları, bir ürünün uygulama bölgesinden hastanın vücuduna nasıl yayıldığını araştırarak maruziyeti değerlendirir. Dökülme, ürünün hastadan çevreye salınımını özel olarak değerlendirir ve vektörün tedavi edilmemiş bireylere bulaşma olasılığını artırır16. FDA, numune toplama sıklığı, numune toplama süresi, toplanan numune türleri ve depolama koşulları ile ilgili olarak biyodağılım ve dökülme çalışmalarının tasarımı için önerilerde bulunur.
Ek olarak, FDA, performans kolaylığı, yüksek verimli format, hızlı geri dönüş süreleri ve tahlil duyarlılığı nedeniyle vektör genomlarının kantitatif tespiti için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonunun (qPCR veya gerçek zamanlı PCR) kullanılmasını önermektedir. Bununla birlikte, moleküler yöntemlerin tasarımı ve performans değerlendirmesi için küçük ve büyük moleküller için mevcut olanlara kıyasla göreceli bir öneri eksikliği vardır. Bu tür çalışmalar için kılavuzların çoğunun, hem ürünlerin hem de tahlillerin kendilerinin benzersiz ve karmaşık tasarımı nedeniyle moleküler yöntemlere uygulanması zordur, bu da önerilen değerlendirmeler için mevcut platformların uygunluğu ve tahlil doğrulaması için uygun yöntemler hakkında sorular ortaya çıkarmaktadır. Bugüne kadar, FDA, PCR tabanlı testlerin resmi olarak doğrulanmasını gerektirmemiştir, ancak EMA bu gerekliliği getirmiştir17. Bu boşluğun ışığında, farklı gruplar ve atölyeler, üreticilerin ve sözleşmeli araştırma kuruluşlarının 18,19,20,21,22,23,24,25’i takip etmeye çalıştıkları beyaz kağıtlar ve öneriler yayınladılar. Bu önerilerin çoğu, yalnızca ilgili görüldüğü şekilde dahil edilen damlacık dijital PCR (ddPCR) gibi gelişmekte olan platformlar için öneriler veya değişiklikler göz önünde bulundurularak qPCR testleri göz önünde bulundurularak yazılmıştır. Daha yeni öneriler, ddPCR testleri için dikkat edilmesi gerekenlere odaklanmıştır, ancak büyük ölçüde, biyoshedding çalışmalarında karşılaşılan karmaşık biyolojik matrislerden ziyade, bir üretim ortamında vektör genom nicelleştirmesine uygulamalarına odaklanmıştır.
Klinik uygulama ve hedeflere bağlı olarak, ddPCR’nin qPCR’ye kıyasla artan duyarlılığı ve matriks girişimlerini ele alma kabiliyeti nedeniyle biyolojik dağılım ve dökülme çalışmalarını desteklemek için ddPCR, qPCR’ye göre tercih edilebilir. Ayrıca, numunelerin yaklaşık 20.000 damlacığa bölünmesi nedeniyle, Poisson istatistikleri kullanılarak standart bir eğri kullanılmadan kopya sayısının doğru bir şekilde ölçülmesi, yöntem geliştirme ve doğrulamayı basitleştirerek elde edilebilir. Bu protokolün amacı, klinik biyodökülme çalışmalarını desteklemek amacıyla oküler yüzeyden toplanan gözyaşlarında AAV vektörlerinin saptanması için ddPCR tabanlı bir yöntemin geliştirilmesi ve doğrulanması için standartlaştırılmış bir yaklaşımı tanımlamaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
ddPCR protokolünün, tahlilin uygun performansı için kritik olan birkaç adımı vardır. İlk kritik adım, astarların ve probun tasarımı ve optimizasyonudur. Genel olarak, hidroliz probu bazlı kimyanın boya bazlı kimya (örneğin, SYBR Green) üzerinde klinik öncesi veya klinik bir ortamda kullanılması, üstün özgüllükleri nedeniyle tavsiye edilir. Ek olarak, amplifikasyon hedefinin seçimi kritik bir konudur. Tipik olarak, vektörün ilgilendiği transgen hedeflenir. Bununla birlikte, daha erken klinik öncesi aşamalarda veya vektör transgenini genomik DNA’ya karşı ayırt etmenin mümkün olmadığı vektörlerde, standartlaştırılmış vektör hedeflerinin kullanılması uygun olabilir. Örneğin, ters çevrilmiş terminal tekrarlama bölgesini, promotörü, poli-A kuyruğunu veya bu vektör bileşenleri arasındaki segmentler arası kavşakları hedefleyebilir. Hedef seçimi vektör tasarımına göre değişecektir. Geleneksel qPCR primer ve prob tasarım stratejileri ve yazılımları genellikle ddPCR için uygundur. Gerekli optimizasyon miktarını azaltmak için tutarlı bir tavlama sıcaklığı (örneğin, 60 ° C) vermesi beklenen tasarım parametreleri seçilmelidir. Ayrıca, her hedef için en az üç farklı kümenin tasarlanması, sıralanması ve değerlendirilmesi önerilmiştir. Daha sonra en büyük özgüllüğü (negatif kontrol kuyusunda veya ilgili hedef DNA’nın matrisinde amplifikasyon yok) ve duyarlılığı (yani, algılama sınırı) gösteren küme seçilmelidir20.
Testi qPCR ve ddPCR arasında geçirebilmek avantajlıysa, önce qPCR kullanarak tahlil koşullarının optimize edilmesi ve seçilen set için R2 ≥ 0.98 ile% 90 -% 110 amplifikasyon verimliliği ile sonuçlanan koşulların belirlenmesi önerilir. Bununla birlikte, bir uç nokta yöntemi olarak ddPCR, amplifikasyon verimliliklerindeki farklılıklar nedeniyle tipik olarak qPCR’den daha az hassastır. En azından, tavlama/uzatma adımında, beklenen tavlama sıcaklıklarının üzerindeki ve altındaki sıcaklıkları kapsayacak ve negatif ve pozitif damlacık kümeleri arasındaki yağmur ve floresan genlik ayrımını sıcaklığın bir fonksiyonu olarak değerlendirmek için bir termal sıcaklık gradyanı çalıştırılması önerilir. Çalışma alanı izin veriyorsa, ana karışım hazırlama, şablon ekleme ve yükseltme için ayrı ayrı özel iş istasyonlarına sahip olmanız önerilir. Mümkün olduğunda, çapraz kontaminasyon ve yanlış pozitiflik riskini azaltmak için bunlar kontrollü erişim ve diferansiyel hava basınçları gibi yerleşik mühendislik kontrollerine sahip tek yönlü bir iş akışı ile fiziksel olarak ayrılmalıdır. Bu mümkün değilse, çapraz kontaminasyonu önlemek için çok dikkatli olunmalıdır.
Bu protokolde, qPCR testi geliştirmeye daha alışkın olanlara alışılmadık görünebilecek iki adım vardır. Birincisi, PCR ana karışımına bir kısıtlama enziminin dahil edilmesidir. ddPCR amplifikasyonu sırasında, her damlacık uç noktaya termosiklüs edilir. Düzgün bir şekilde optimize edilmiş bir tahlilde, bu, iki damlacık popülasyonu ile sonuçlanır, bir set sürekli olarak yüksek düzeyde floresan sinyalleri (pozitifler) gösterirken, diğeri sürekli olarak düşük seviyede floresan sinyali (negatifler) gösterir. PCR girişimi meydana gelirse, PCR amplifikasyonunun başlatılmasını senkronize edebilir, bu da damlacığın bir amplifikasyon platosuna ulaşmamasına ve dolayısıyla tutarsız floresan uç noktalarına neden olabilir. Bu durumda, damlacıklar negatifler ve pozitifler arasında dağılacak ve ddPCR yağmuru adı verilen bir fenomenle sonuçlanacaktır. Bu, hedefin yanlış ölçülmesine ve tutarsız ve öznel olarak uygulanan eşiklere neden olabilir. Eşiği NTC’nin sinyalinin biraz üzerine ayarlama önerimiz, tüm damlacıklar son noktaya tam olarak çevrilmemiş olsa bile, tüm damlacıklar hala pozitif olarak kabul edildiğinden, nihai nicelemede yağmurun etkilerini en aza indirgemelidir. AAV’ler, amplifikasyon hedefine bağlı olarak, primerlere ve problara erişilebilirliği azaltabilecek, PCR parazitine ve dolayısıyla yağmura neden olabilecek oldukça karmaşık bir ikincil yapıya sahiptir. Restriksiyon enziminin ana karışıma dahil edilmesi, primerlerin ve probların erişimini arttırmak için bu ikincil yapıyı ayırır, yağmuru azaltır, böylece tahlilin doğruluğunu artırabilir. ddPCR reaksiyonuna bir restriksiyon enziminin dahil edilmesinin etkileri daha önce25,32 olarak tanımlanmıştır. Herhangi bir kısıtlama enzimi, hedef amplifikasyon bölgesi içinde kesilmediği doğrulandığı sürece kullanılabilir. Ön sindirim adımlarına veya alternatif tampon bileşimlerine gerek yoktur.
İkinci olağandışı adım, AAV içeren gözyaşı örneğinin hazırlanmasıdır. Bu protokolde, 1:10 (veya daha büyük) gözyaşı oranı kullanıldı ve daha sonra numune ısıtıldı. Tipik olarak, gözyaşları yaygın olarak kullanılan bir toplama yöntemi olan kılcal bir tüp aracılığıyla toplandığında, ortalama olarak yaklaşık 10.0 μL toplanabilir33. Seyreltme, sınırlı numune hacminin ele alınmasına yardımcı olur ve yinelenen kuyu testi için yeterli malzeme sağlar. Bu, algılamanın teorik sınırını azaltırken, ddPCR’nin sağlam hassasiyeti, son derece az sayıda vektör parçacığı dışında hepsinin algılanmasıyla sonuçlanmalıdır. Bu yaklaşım ayrıca, beklenmedik bir şekilde başarısız olması durumunda bir “yedekleme” kuyusu oluşturur. Bu durumda veya iki kuyucuğu çalıştırmak için yetersiz numune hacmi durumunda, hassasiyeti değerlendirmek için Poisson hatası kullanılabilir. Ayrıca, konsantrasyonun tespit sınırının altında olduğu durumlarda, bir konsantrasyonu belirlemek için iyi verileri birleştirme fırsatı yaratır. ddPCR tespiti için AAV vektörlerinin viral kapsidlerden serbest bırakılması gerekir. AAV’nin nicelleştirilmesi için bazı yöntemler, viral kapsid34,35,36’yı çıkarmak için bir proteinaz K sindirim adımı içermektedir. Doğal olarak oluşan tüm AAV serotipleri, çoğu 80 ° C’nin altına düşen, yaklaşık 90 ° C’de veya altında erime sıcaklıklarına sahiptir; bu nedenle, bu gereksiz bir dahil etmegibi görünmektedir 37. Tek başına ısıtma, vektör DNA’sını serbest bırakmak için yeterli görünmektedir.
Ayrıca, ddPCR genellikle bir qPCR testini etkileyebilecek bir numunede bulunabilecek PCR inhibitörlerine karşı daha az hassastır. Belirli bir DNA izolasyon adımı dahil edilirse, bu aynı zamanda bu protokolde kaçınılan spesifik doğrulama gerektirir. Numuneler, vektör genomlarının bir sıvı içindeki difüzyonunun kinetiği nedeniyle ısıtmadan önce seyreltilir. Isıtma ve müteakip soğutma işlemi sırasında, tek sarmallı DNA genomunun pozitif ve negatif duyu iplikçikleri, konsantrasyonlar yeterince yüksekse, çift sarmallı bir ara ürün üretmek için birlikte tavlanabilir. Isıtmadan önce seyreltme, konsantrasyonları azaltır ve nicelemenin doğruluğu üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olmak için yeterli çift sarmallı ara ürünlerin oluşmasını matematiksel olarak olası kılmaz. Kalite kontrol olarak kullanılan sentetik DNA fragmanlarının veya doğrusallaştırılmış plazmidlerin bu ısıtma adımından geçmemesi gerektiği unutulmamalıdır. Bunlar çift sarmallı olduğundan, ısıtma tek sarmallı ara ürünlere dönüşümle sonuçlanır. Bu tek sarmallı QC’lerin damlacıklara bağımsız olarak bölünmesinin ardından, bunun nominal konsantrasyona göre QC konsantrasyonunda iki kat artışa neden olması beklenir. Alternatif olarak, QC’ler yöntemi standartlaştırmak için ısıtılacaksa, bu, nominal bir konsantrasyonun yeniden yapılandırılması ve atanması için hesaba katılmalıdır.
Son olarak, numune hazırlama ile ilgili olarak, birçok protokol, kapsüllenmemiş vektör DNA’sını çıkarmak için bir DNaz tedavi adımının dahil edilmesini de önermektedir. Bu adım, vektör preparasyonu ile ilişkili serbest DNA’nın nicelleştirilmesinin istenmediği durumlarda kritik öneme sahiptir (dozaj amacıyla nicelleştirme sırasında olduğu gibi). Bununla birlikte, biyodağılım ve biyodökülme çalışmaları bağlamında, tipik olarak, kapsüllenmiş olup olmadığına bakılmaksızın, herhangi bir vektör DNA’sının nereye gittiğini bilmek istenir. Bu nedenle, bu tür çalışmalar sırasında tipik olarak bir DNaz tedavi adımı gerçekleştirilmemesi önerilmektedir. Bir DNaz adımının dahil edilmesinin gerekli olduğu belirlenirse, bu adım seyreltme ve ısıtmadan önce olmalıdır.
Bu yazıda, yöntemin dinamik aralığının, duyarlılığının, doğruluğunun ve hassasiyetinin amaca uygun, iyi laboratuvar uygulamalarına uygun bir doğrulama bağlamında değerlendirilmesine yönelik yaklaşımı temsil eden veriler sunulmuştur. Bu konudaki mevcut rehberlik eksikliği, mevcut endüstri düşüncesine uygun olarak, kendileri için hedef tahlil kriterlerini belirlemek için doğrulama laboratuvarlarını bırakmaktadır. Farklı gruplar bu çalışmada kullanılandan hem daha yüksek hem de daha düşük hedef kriterler ortaya koymuştur 19,20,21,22,23,24,25. Hedef tahlil kriterleri, daha katı bir şekilde tanımlanana kadar, yöntemin amaçlanan klinik uygulamalarına dayanarak validasyondan önce seçilmelidir. Verilere dayanarak verilecek aşağı akış kararlarına bağlı olarak, daha yüksek doğruluk ve hassasiyet seviyelerine ihtiyaç duyulabilir. Tersine, basit bir pozitif ve negatif sonuç yeterli olabilir.
Yaklaşım ayrıca özgüllüğün ve matris etkisinin değerlendirilmesi için önerileri de ele aldı. Tedavi edilmemiş bireylerden toplanan bir gözyaşı havuzu bu tahlilde olumlu bir sonuç veremedi, oysa vektör önerilen iyileşme oranları içinde yüksek ve düşük bir konsantrasyonda gözyaşlarına çivilendiğinde hedef tespit edilebildi. İdeal olarak, endojen vektör içeren matris (örneğin, viral vektör ile tedaviden sonra toplanan) da bu değerlendirmelere dahil edilecektir. Ancak, bu tür örneklerin bir doğrulamada kullanılmak üzere mevcut olması olası değildir. Doğrulamanın sağlamlığını arttırmak için, hastaya özgü bir matris etkisinin meydana gelip gelmediğini belirlemek için birden fazla gözyaşı havuzu veya çeşitli bireylerden toplanan gözyaşları değerlendirilebilir. Son olarak, kararlılığın değerlendirilmesi önerilir. DNA ekstraksiyonunun biyolojik matristen gerçekleştiği iş akışlarında, hem numunenin hem de ekstrakte edilen DNA’nın stabilitesini değerlendirmek gerekebilir. Bu iş akışında, numune DNA ekstraksiyonuna gerek kalmadan doğrudan tahlilde test edilir. Bu nedenle, bu yöntem için stabilitenin değerlendirilmesi göz önüne alındığında, gözyaşı örneklerinin stabilitesinin değerlendirilmesi gerekir. Tipik olarak, tezgah üstü, buzdolabı, donma/çözme ve uzun vadeli stabilite değerlendirmeleri önerilir. Bunlar bu çalışmanın bir parçası olarak gerçekleştirilmemiştir, ancak burada geliştirilen yöntemler, giriş örneklerine yapılan manipülasyonları takiben bu değerlendirmede kullanılabilir.
Genel olarak, bu yöntemin gözyaşı örneklerinde AAV tabanlı vektörleri tespit etmek için sağlam, tekrarlanabilir ve doğrulanabilir bir test olduğu gösterilmiştir. Klinik çalışmaları desteklemek için belirli vektörlere uyarlanacak bir platform görevi görebilir ve iyi laboratuvar uygulamalarıyla tutarlı bir tahlilin doğrulanması için bir temel sağlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bio-Rad’dan Nick Russell ve Brandon McKethan’a bu yöntemin geliştirilmesi sırasındaki yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz.
Materials
| AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
| AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
| DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
| PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
| Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
| Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
| Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
| Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
| TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
| Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |
References
- Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. Is it ‘gene therapy. Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).
- Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update. The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).
- Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
- Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy Available from: https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx (2022)
- Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products (2022)
- Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).
- Lundstrom, K. Viral vectors in gene therapy. Diseases. 6 (2), 42 (2018).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31, 317-334 (2017).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug (2020)
- Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products (2020)
- Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during (2020)
- Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy (2016)
- Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency Available from: https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy (2023)
- Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders (2020)
- Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products (2015)
- Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf (2018)
- Kaur, S. white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A – recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B – regulatory agencies’ inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine). Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).
- Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories. The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).
- Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).
- Wissel, M. Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC. Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).
- Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme Available from: https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf (2018)
- Pinheiro, L., Emslie, K. R. Basic concepts and validation of digital PCR measurements. Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).
- Tzonev, S. Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean. Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).
- Prantner, A., Marr, D. Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR. PLoS One. 18, 0280242 (2023).
- Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/ (2023)
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer 3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Ye, J. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf (2023)
- Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Basu, A. Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR. SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).
- Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
- Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11, 10064 (2021).
- Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR. Genes. 12 (4), 601 (2021).
- Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate. Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Bennett, A., et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).
