Un ensayo validable de reacción digital de la polimerasa en cadena de gotas para la detección de vectores virales adenoasociados en estudios de bioderramamiento de lágrimas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y validación de buenas prácticas de laboratorio en la detección compatible de vectores virales adenoasociados en lágrimas humanas por reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas en apoyo del desarrollo clínico de vectores de terapia génica.
Abstract
El uso de vectores virales para tratar enfermedades genéticas ha aumentado sustancialmente en los últimos años, con más de 2.000 estudios registrados hasta la fecha. Los vectores virales adenoasociados (AAV) han tenido un éxito particular en el tratamiento de enfermedades relacionadas con los ojos, como lo ejemplifica la aprobación del voretigene neparvovec-rzyl. Para llevar nuevas terapias al mercado, las agencias reguladoras generalmente solicitan estudios de biodiseminación calificados o validados para evaluar la liberación del vector en el medio ambiente. Sin embargo, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos no ha publicado directrices oficiales para el desarrollo de ensayos moleculares para respaldar tales estudios de desprendimiento, lo que deja a los desarrolladores determinar las mejores prácticas por sí mismos. El propósito de este protocolo es presentar un protocolo validable para la detección de vectores AAV en lágrimas humanas por reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas (ddPCR) en apoyo de estudios clínicos de bioderramamiento. Este manuscrito analiza los enfoques actuales de la industria para la validación de ensayos moleculares y demuestra que el método excede los criterios de aceptación del ensayo objetivo actualmente propuestos en los libros blancos. Finalmente, se discuten los pasos críticos en el desempeño de cualquier ensayo de ddPCR, independientemente de la aplicación.
Introduction
Las definiciones de terapia génica varían, pero generalmente inducen una alternancia permanente intencional y a menudo esperada de una secuencia específica de ADN del genoma celular para modificar o manipular la expresión de un gen o alterar las propiedades biológicas de una célula viva con un propósito clínico 1,2. Los vectores virales se utilizan cada vez más como vehículos para la terapia génica debido a su eficiencia de transducción, con un informe que sugiere que más del 70% de los ensayos clínicos actuales de terapia génica utilizan vectores virales3. El interés en los vectores virales para la terapia génica ha ido ganando constantemente. El Informe de datos trimestrales del cuarto trimestre de 2022 sobre el panorama de la terapia génica, celular y de ARN de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular informó que en 2022, la línea de terapia de genes, células y ARN desde la preclínica hasta el registro previo creció un 7%, lo que elevó el número total de terapias en desarrollo a 3,726, de las cuales 2,053 (55%) fueron terapias génicas4. La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (EE.UU. FDA) ha aprobado actualmente 27 terapias celulares y genéticas para uso clínico en humanos, cinco de las cuales utilizan específicamente vectores virales5.
Los virus adenoasociados (AAV) han ganado un interés específico como vehículos para la terapia génica. Un metaanálisis reciente reveló que ha habido aproximadamente 136 ensayos clínicos que investigan el uso de AAV en las últimas dos décadas6. Además, tres de las cinco terapias génicas aprobadas por la FDA de EE.UU. están basadas en AAV. Esto se debe a su naturaleza altamente editable, amplia gama de huéspedes que puede ajustarse en función del uso de vectores naturales específicos o artificialmente diseñados, baja patogenicidad y toxicidad en humanos y, en general, baja inmunogenicidad 7,8. Los AAV también se han utilizado con éxito para tratar enfermedades oculares en un entorno clínico aprobado. Voretigene neparvovec-rzyl es una terapia basada en AAV2 que fue aprobada por la FDA de EE.UU. en 2017 y por la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) en 2018 para tratar la distrofia retiniana asociada a la mutación bialélica RPE65 9.
Con el creciente interés en el desarrollo de terapias basadas en AAV viene la necesidad de orientación regulatoria sobre ensayos. La detección y cuantificación precisas de cualquier vector viral es una parte integral de las fases de descubrimiento, fabricación y pruebas preclínicas / clínicas del desarrollo del producto. La FDA de los Estados Unidos ha comenzado a emitir algunas directrices para las terapias génicas, incluidas las aplicaciones de nuevos fármacos en investigación de la química, la fabricación y el control de la terapia génica humana 10, el seguimiento a largo plazo después de la administración de la terapia génica11, las pruebas de retrovirus competentes en replicación 12 y las recomendaciones para los vectores microbianos utilizados en las terapias génicas 13. La EMA también ha publicado una serie de directrices sobre el desarrollo de productos de terapia génica que generalmente se alinean con las recomendaciones de la FDA, aunque existen algunas diferencias14. Es importante tener en cuenta que, si bien estas directrices no establecen responsabilidades legalmente exigibles, excepto cuando se hace referencia a regulaciones específicas, proporcionan claridad sobre el pensamiento actual de las agencias reguladoras sobre el tema y sus expectativas para los ensayos requeridos para la presentación de medicamentos y la aprobación regulatoria.
La FDA recomienda específicamente que se realicen estudios para evaluar la distribución, persistencia y eliminación de un vector desde el sitio de administración hasta los tejidos oculares y no oculares, los fluidos intraoculares y la sangre15. Estos toman la forma de estudios de biodistribución y desprendimiento. Los estudios de biodistribución evalúan la exposición investigando cómo se propaga un producto por todo el cuerpo de un paciente desde el sitio de administración. El derramamiento evalúa específicamente la liberación del producto del paciente al medio ambiente y plantea la posibilidad de transmisión del vector a individuos no tratados16. La FDA hace recomendaciones para el diseño de estudios de biodistribución y derramamiento con respecto a la frecuencia de recolección de muestras, la duración de la recolección de muestras, los tipos de muestras recolectadas y las condiciones de almacenamiento.
Además, la FDA recomienda el uso de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR o PCR en tiempo real) para la detección cuantitativa de genomas de vectores debido a su facilidad de rendimiento, formato de alto rendimiento, tiempos de respuesta rápidos y sensibilidad al ensayo. Sin embargo, hay una relativa falta de recomendaciones para el diseño y la evaluación del rendimiento de los métodos moleculares en comparación con los que existen para moléculas pequeñas y grandes. Muchas de las directrices para tales estudios son difíciles de aplicar a los métodos moleculares debido al diseño único y complejo tanto de los productos como de los propios ensayos, lo que plantea dudas sobre la idoneidad de las plataformas disponibles para las evaluaciones recomendadas y los métodos apropiados para la validación de ensayos. Hasta la fecha, la FDA no ha requerido la validación formal de los ensayos basados en PCR, aunque la EMA ha impuesto este requisito17. A la luz de este vacío, diferentes grupos y talleres han emitido libros blancos y recomendaciones que los fabricantes y las organizaciones de investigación por contrato han tratado de seguir 18,19,20,21,22,23,24,25. La mayoría de estas recomendaciones están escritas específicamente teniendo en cuenta los ensayos de qPCR, con sugerencias o alteraciones para plataformas emergentes, como la PCR digital de gotas (ddPCR), incluidas solo cuando se consideran relevantes. Las recomendaciones más recientes se han centrado en las consideraciones para los ensayos de ddPCR, pero se han centrado en gran medida en sus aplicaciones a la cuantificación del genoma vectorial en un entorno de fabricación en lugar de en las complejas matrices biológicas encontradas en los estudios de biodesprendimiento.
Dependiendo de la aplicación clínica y los objetivos, se puede preferir la ddPCR a la qPCR en apoyo de los estudios de biodistribución y eliminación debido a la mayor sensibilidad y capacidad de la ddPCR para manejar la interferencia de la matriz en comparación con la qPCR. Además, debido a la partición de muestras en aproximadamente 20.000 gotas, se puede lograr una cuantificación precisa del número de copias sin el uso de una curva estándar utilizando estadísticas de Poisson, simplificando el desarrollo y la validación del método. El objetivo de este protocolo es describir un enfoque estandarizado para el desarrollo y validación de un método basado en ddPCR para la detección de vectores AAV en lágrimas recogidas de la superficie ocular en apoyo de estudios clínicos de biodesprendimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos del protocolo ddPCR que son críticos para el correcto desempeño del ensayo. El primer paso crítico es el diseño y la optimización de los cebadores y la sonda. En general, se recomienda el uso de química basada en sonda de hidrólisis sobre química basada en colorantes (por ejemplo, SYBR Green) en un entorno preclínico o clínico debido a su especificidad superior. Además, la elección del objetivo de amplificación es crítica. Típicamente, el transgén de interés del vector es el objetivo. Sin embargo, en etapas preclínicas más tempranas o en vectores donde puede no ser posible distinguir el transgén vectorial frente al ADN genómico, puede ser apropiado utilizar dianas vectoriales estandarizadas. Por ejemplo, uno podría apuntar a la región de repetición terminal invertida, promotor, cola poli-A o las uniones entre segmentos entre estos componentes vectoriales. La elección del objetivo variará según el diseño vectorial. Las estrategias y el software tradicionales de diseño de sondas y cebadores qPCR suelen ser apropiados para ddPCR. Los parámetros de diseño que se espera que produzcan una temperatura de recocido constante (por ejemplo, 60 °C) deben seleccionarse para reducir la cantidad de optimización requerida. También se ha recomendado diseñar, ordenar y evaluar al menos tres conjuntos diferentes para cada objetivo. A continuación, se debe seleccionar el conjunto que muestre la mayor especificidad (sin amplificación en el pozo de control negativo o en una matriz de ADN objetivo relacionado) y sensibilidad (es decir, límite de detección)20.
Si es ventajoso poder hacer la transición del ensayo entre qPCR y ddPCR, se recomienda optimizar primero las condiciones del ensayo utilizando qPCR e identificar condiciones para el conjunto seleccionado que resulten en eficiencias de amplificación del 90% -110% con un R2 ≥ 0.98. Sin embargo, la ddPCR como método de criterio de valoración suele ser menos sensible que la qPCR debido a las variaciones en las eficiencias de amplificación. Como mínimo, se recomienda ejecutar un gradiente de temperatura térmica en la etapa de recocido/extensión para cubrir temperaturas por encima y por debajo de las temperaturas de recocido esperadas y para evaluar la separación de amplitud de lluvia y fluorescente entre los grupos de gotas negativas y positivas en función de la temperatura. Si el espacio de trabajo lo permite, se recomienda tener estaciones de trabajo dedicadas individuales para la preparación de la mezcla maestra, la adición de plantillas y la amplificación. Siempre que sea posible, estos deben ser separados físicamente por un flujo de trabajo unidireccional con controles de ingeniería incorporados, como acceso controlado y presiones de aire diferenciales, para reducir el riesgo de contaminación cruzada y falsos positivos. Si esto no es posible, se debe tener extrema precaución para evitar la contaminación cruzada.
Hay dos pasos en este protocolo que pueden parecer inusuales para aquellos que están más acostumbrados al desarrollo de ensayos de qPCR. El primero es la inclusión de una enzima de restricción en la mezcla maestra de PCR. Durante la amplificación por ddPCR, cada gota se termocicla hasta el punto final. En un ensayo correctamente optimizado, esto da como resultado dos poblaciones de gotas, un conjunto que muestra un nivel consistentemente alto de señales fluorescentes, los positivos, y otro que muestra consistentemente un bajo nivel de señal fluorescente, los negativos. Si se produce interferencia de PCR, puede desincronizar el inicio de la amplificación por PCR, lo que hace que la gota no alcance una meseta de amplificación y, por lo tanto, puntos finales fluorescentes inconsistentes. En este caso, las gotitas se distribuirán entre los negativos y los positivos, lo que resulta en un fenómeno llamado lluvia ddPCR. Esto puede dar lugar a una cuantificación inexacta del objetivo y a umbrales aplicados de manera incoherente y subjetiva. Nuestra recomendación es establecer el umbral ligeramente por encima de la señal del NTC, lo que debería minimizar los efectos de la lluvia en la cuantificación final, ya que todas las gotas aún se consideran positivas, incluso si no se ciclan completamente hasta el punto final. Los AAV tienen una estructura secundaria altamente compleja que, dependiendo del objetivo de amplificación, puede reducir la accesibilidad a los cebadores y sondas, lo que resulta en interferencia de PCR y, por lo tanto, lluvia. La inclusión de la enzima de restricción en la mezcla maestra escinde esta estructura secundaria para aumentar el acceso de los cebadores y sondas, reduciendo la lluvia, lo que puede mejorar la precisión del ensayo. Los efectos de la inclusión de una enzima de restricción en la reacción ddPCR han sido descritos previamente25,32. Se puede usar cualquier enzima de restricción, siempre y cuando se confirme que no corta dentro de la región de amplificación objetivo. No se requieren pasos de predigestión o composiciones tampón alternativas.
El segundo paso inusual es la preparación de la muestra de lágrimas que contiene AAV. En este protocolo, se utilizó una proporción de lágrimas de 1:10 (o mayor) y posteriormente se calentó la muestra. Por lo general, cuando las lágrimas se recogen a través de un tubo capilar, que es un método de recolección ampliamente utilizado, en promedio se pueden recolectar aproximadamente 10.0 μL33. La dilución ayuda a abordar el volumen limitado de la muestra y proporciona suficiente material para la prueba de pozos duplicados. Si bien esto reduce el límite teórico de detección, la robusta sensibilidad de ddPCR aún debería resultar en la detección de todas las partículas vectoriales, excepto de muy pocas. Este enfoque también crea un pozo de “copia de seguridad” si uno fallara inesperadamente. En este caso, o en casos de volumen de muestra insuficiente para ejecutar dos pozos, el error de Poisson podría usarse para evaluar la precisión. Además, en los casos en que la concentración está por debajo del límite de detección, crea una oportunidad para combinar datos de pozos para determinar una concentración. Es necesario liberar los vectores AAV de las cápsides virales para la detección de ddPCR. Algunos métodos para la cuantificación de AAV han incluido un paso de digestión de proteinasa K para eliminar la cápside viral34,35,36. Todos los serotipos AAV naturales tienen temperaturas de fusión iguales o inferiores a aproximadamente 90 °C, y la mayoría cae por debajo de 80 °C; por lo tanto, esto parece ser una inclusión innecesaria37. El calentamiento por sí solo parece ser suficiente para liberar el ADN vectorial.
Además, la ddPCR es generalmente menos susceptible a los inhibidores de PCR que pueden estar presentes en una muestra que puede afectar a un ensayo de qPCR. Si se incluye un paso específico de aislamiento de ADN, esto también requeriría una validación específica, que se evita en este protocolo. Las muestras se diluyen antes del calentamiento debido a la cinética de difusión de los genomas vectoriales en un líquido. Durante el proceso de calentamiento y enfriamiento posterior, las hebras sensoriales positivas y negativas del genoma de ADN monocatenario pueden unirse para producir un intermedio bicatenario si las concentraciones son lo suficientemente altas. La dilución antes del calentamiento reduce las concentraciones y hace matemáticamente improbable que se formen suficientes productos intermedios bicatenarios para tener un efecto adverso en la precisión de la cuantificación. Cabe señalar que los fragmentos de ADN sintético o plásmidos linealizados utilizados como controles de calidad no deben someterse a este paso de calentamiento. Como estos son de doble cadena, el calentamiento daría como resultado la conversión a intermedios de una sola cadena. Después de la partición independiente de estos QC monocatenarios en gotas, se esperaría que esto resultara en un aumento de dos veces en la concentración de QC en relación con la concentración nominal. Alternativamente, si los CC deben calentarse para estandarizar el método, esto debe tenerse en cuenta en la reconstitución y asignación de una concentración nominal.
Finalmente, con respecto a la preparación de la muestra, muchos protocolos también recomiendan la inclusión de un paso de tratamiento de DNasa para eliminar cualquier ADN vector no encapsidado. Este paso es crítico en los casos en que no se desea cuantificar el ADN libre asociado con la preparación del vector (como durante la cuantificación para fines de dosificación). Sin embargo, en el contexto de los estudios de biodistribución y biodesprendimiento, uno típicamente desea saber dónde ha viajado cualquier ADN vectorial, independientemente de si está encapsidado o no. Por lo tanto, se sugiere típicamente no realizar un paso de tratamiento con DNasa durante dichos estudios. Si se determina que es necesario incluir un paso de DNasa, este paso debe ser previo a las diluciones y el calentamiento.
En este documento, se presentan datos representativos del enfoque para la evaluación del rango dinámico, la sensibilidad, la exactitud y la precisión del método en el contexto de una validación adecuada para el propósito y conforme a las buenas prácticas de laboratorio. La falta actual de orientación sobre este tema deja a los laboratorios de validación para determinar los criterios de ensayo objetivo por sí mismos, en línea con el pensamiento actual de la industria. Diferentes grupos han planteado criterios objetivo más altos y más bajos que los utilizados en este estudio 19,20,21,22,23,24,25. Los criterios del ensayo objetivo, hasta que se definan de forma más rígida, deben seleccionarse antes de la validación en función de las aplicaciones clínicas previstas del método. Dependiendo de las decisiones posteriores que se tomen sobre la base de los datos, pueden ser necesarios niveles más altos de exactitud y precisión. Por el contrario, un simple resultado positivo versus negativo puede ser suficiente.
El enfoque también abordó recomendaciones para la evaluación de la especificidad y un efecto matricial. Un conjunto de lágrimas recogidas de individuos no tratados no produjo un resultado positivo en este ensayo, mientras que el objetivo pudo detectarse cuando el vector se clavó en las lágrimas a una concentración alta y baja dentro de las tasas de recuperación recomendadas. Idealmente, la matriz que contiene vector endógeno (por ejemplo, recolectado después del tratamiento con vector viral) también se incluiría en estas evaluaciones. Sin embargo, es poco probable que tales muestras estén disponibles para su uso en una validación. Para aumentar la solidez de la validación, se pudieron evaluar múltiples grupos de lágrimas, o lágrimas recolectadas de una variedad de individuos, para determinar si se produce un efecto de matriz específico del paciente. Finalmente, se recomienda evaluar la estabilidad. En flujos de trabajo donde la extracción de ADN ocurre fuera de la matriz biológica, puede ser necesario evaluar la estabilidad tanto de la muestra como del ADN extraído. En este flujo de trabajo, la muestra se prueba directamente en el ensayo sin necesidad de extracción de ADN. Por lo tanto, en consideración de la evaluación de la estabilidad para este método, se debe evaluar la estabilidad de las muestras de lágrimas. Por lo general, se recomiendan evaluaciones de sobremesa, refrigerador, congelación / descongelación y estabilidad a largo plazo. Estos no se realizaron como parte de este estudio, pero los métodos desarrollados aquí pueden ser utilizados en esta evaluación, después de manipulaciones a las muestras de entrada.
En general, se ha demostrado que este método es un ensayo robusto, repetible y validable para detectar vectores basados en AAV en muestras de lágrimas. Puede servir como plataforma para adaptarse a vectores específicos para apoyar los ensayos clínicos y proporciona una base para la validación de un ensayo coherente con las buenas prácticas de laboratorio.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Nick Russell y Brandon McKethan de Bio-Rad por sus útiles discusiones durante el desarrollo de este método.
Materials
| AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
| AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
| DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
| PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
| Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
| Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
| Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
| Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
| TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
| Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |
References
- Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. Is it ‘gene therapy. Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).
- Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update. The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).
- Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
- Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy Available from: https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx (2022)
- Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products (2022)
- Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).
- Lundstrom, K. Viral vectors in gene therapy. Diseases. 6 (2), 42 (2018).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31, 317-334 (2017).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug (2020)
- Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products (2020)
- Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during (2020)
- Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy (2016)
- Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency Available from: https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy (2023)
- Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders (2020)
- Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products (2015)
- Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf (2018)
- Kaur, S. white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A – recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B – regulatory agencies’ inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine). Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).
- Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories. The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).
- Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).
- Wissel, M. Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC. Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).
- Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme Available from: https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf (2018)
- Pinheiro, L., Emslie, K. R. Basic concepts and validation of digital PCR measurements. Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).
- Tzonev, S. Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean. Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).
- Prantner, A., Marr, D. Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR. PLoS One. 18, 0280242 (2023).
- Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/ (2023)
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer 3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Ye, J. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf (2023)
- Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Basu, A. Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR. SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).
- Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
- Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11, 10064 (2021).
- Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR. Genes. 12 (4), 601 (2021).
- Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate. Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Bennett, A., et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).
