مقايسة تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي للقطرات القابلة للتحقق من صحتها للكشف عن النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي في دراسات الدموع البيولوجية
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لتطوير الممارسات المختبرية الجيدة والتحقق من صحتها في الكشف المتوافق عن النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي في الدموع البشرية عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي لدعم التطوير السريري لنواقل العلاج الجيني.
Abstract
ازداد استخدام النواقل الفيروسية لعلاج الأمراض الوراثية بشكل كبير في السنوات الأخيرة ، حيث تم تسجيل أكثر من 2000 دراسة حتى الآن. حققت النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي (AAV) نجاحا خاصا في علاج الأمراض المرتبطة بالعين ، كما يتضح من الموافقة على voretigene neparvovec-rzyl. لجلب علاجات جديدة إلى السوق ، تطلب الوكالات التنظيمية عادة دراسات بيولوجية مؤهلة أو معتمدة لتقييم إطلاق الناقل في البيئة. ومع ذلك ، لم تصدر إدارة الغذاء والدواء الأمريكية أي مبادئ توجيهية رسمية لتطوير المقايسات الجزيئية لدعم دراسات التساقط هذه ، تاركة للمطورين تحديد أفضل الممارسات لأنفسهم. الغرض من هذا البروتوكول هو تقديم بروتوكول قابل للتحقق من صحته للكشف عن ناقلات AAV في الدموع البشرية عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي (ddPCR) لدعم دراسات التكاثر البيولوجي السريرية. تناقش هذه المخطوطة مناهج الصناعة الحالية للتحقق من صحة الفحص الجزيئي وتوضح أن الطريقة تتجاوز معايير قبول الفحص المستهدف المقترحة حاليا في الأوراق البيضاء. أخيرا ، تتم مناقشة الخطوات الحاسمة في أداء أي مقايسة ddPCR ، بغض النظر عن التطبيق.
Introduction
تختلف تعريفات العلاج الجيني ، ولكنها تحفز بشكل عام تناوبا دائما مقصودا ومتوقعا في كثير من الأحيان لتسلسل معين من الحمض النووي للجينوم الخلوي لتعديل أو التلاعب بتعبير الجين أو لتغيير الخصائص البيولوجية للخلية الحية لغرض سريري 1,2. يتم استخدام النواقل الفيروسية بشكل متزايد كوسيلة للعلاج الجيني بسبب كفاءتها في النقل ، حيث يشير أحد التقارير إلى أن أكثر من 70٪ من التجارب السريرية الحالية للعلاج الجيني تستخدم النواقل الفيروسية3. يزداد الاهتمام بالنواقل الفيروسية للعلاج الجيني بشكل مطرد. أفاد تقرير البيانات الفصلية للربع 4 2022 حول مشهد العلاج بالجينات والخلايا والحمض النووي الريبي من الجمعية الأمريكية للعلاج الجيني والخلوي أنه في عام 2022 ، نما خط أنابيب العلاج بالجينات والخلايا والحمض النووي الريبي من التسجيل قبل السريري إلى التسجيل المسبق بنسبة 7٪ ، ليصل العدد الإجمالي للعلاجات قيد التطوير إلى 3,726 ، منها 2,053 (55٪) علاجات جينية4. وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (USA FDA) حاليا على 27 علاجا للخلايا والجينات للاستخدام السريري في البشر ، خمسة منها تستخدم على وجه التحديد النواقل الفيروسية5.
اكتسبت الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAVs) اهتماما خاصا كوسيلة للعلاج الجيني. كشف تحليل تلوي حديث أن هناك ما يقرب من 136 تجربة سريرية تحقق في استخدام AAVs في العقدين الماضيين6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ثلاثة من العلاجات الجينية الخمسة المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية تعتمد على AAV. ويرجع ذلك إلى طبيعتها القابلة للتحرير بدرجة كبيرة ، ونطاق المضيف الواسع الذي يمكن ضبطه بناء على استخدام نواقل محددة تحدث بشكل طبيعي أو مهندسة صناعيا ، وانخفاض الإمراضية والسمية في البشر ، وانخفاض المناعةبشكل عام 7,8. كما تم استخدام AAVs بنجاح لعلاج أمراض العين في بيئة سريرية معتمدة. Voretigene neparvovec-rzyl هو علاج قائم على AAV2 تمت الموافقة عليه من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية في عام 2017 ومن قبل وكالة الأدوية الأوروبية (EMA) في عام 2018 لعلاج حثل الشبكية المرتبط بالطفرة ثنائية الأليلي RPE65 9.
مع الاهتمام المتزايد بتطوير العلاجات القائمة على AAV تأتي الحاجة إلى التوجيه التنظيمي بشأن المقايسات. يعد الكشف الدقيق عن أي ناقل فيروسي وقياسه جزءا لا يتجزأ من مراحل الاكتشاف والتصنيع والاختبار قبل السريري / السريري لتطوير المنتج. بدأت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية في إصدار بعض الإرشادات للعلاجات الجينية ، بما في ذلك الكيمياء والتصنيع والتحكم في تطبيقات الأدوية الجديدة التجريبية للعلاج الجيني البشري 10 ، والمتابعة طويلة الأجل بعد إعطاء العلاج الجيني 11 ، واختبار الفيروس القهقري المؤهل للتكرار12 ، والتوصيات الخاصة بالنواقل الميكروبية المستخدمة في العلاجات الجينية 13. أصدرت EMA أيضا سلسلة من الإرشادات المتعلقة بتطوير منتجات العلاج الجيني التي تتوافق بشكل عام مع توصيات إدارة الغذاء والدواء ، على الرغم من وجود بعض الاختلافات14. من المهم ملاحظة أنه على الرغم من أن هذه الإرشادات لا تحدد مسؤوليات قابلة للتنفيذ قانونا ، إلا في حالة الإشارة إلى لوائح محددة ، إلا أنها توفر وضوحا بشأن التفكير الحالي من الوكالات التنظيمية حول هذا الموضوع وتوقعاتها للمقايسات المطلوبة لإيداعات الأدوية والموافقة التنظيمية.
توصي إدارة الغذاء والدواء على وجه التحديد بإجراء دراسات لتقييم توزيع وثبات وتخليص ناقل من موقع الإعطاء لاستهداف أنسجة العين وغير العين والسوائل داخل العين والدم15. هذه تأخذ شكل التوزيع البيولوجي ودراسات سفك. تقوم دراسات التوزيع الحيوي بتقييم التعرض من خلال التحقيق في كيفية انتشار المنتج في جميع أنحاء جسم المريض من موقع الإدارة. يقيم سفك على وجه التحديد إطلاق المنتج من المريض إلى البيئة ويزيد من إمكانية انتقال الناقل إلى الأفراد غير المعالجين16. تقدم إدارة الغذاء والدواء توصيات لتصميم دراسات التوزيع الحيوي وسفك فيما يتعلق بتكرار جمع العينات ومدة جمع العينات وأنواع العينات التي تم جمعها وظروف التخزين.
بالإضافة إلى ذلك ، توصي إدارة الغذاء والدواء الأمريكية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي) للكشف الكمي عن جينومات النواقل نظرا لسهولة أدائها ، وتنسيقها عالي الإنتاجية ، وأوقات التسليم السريعة ، وحساسية الفحص. ومع ذلك ، هناك نقص نسبي في التوصيات الخاصة بتصميم وتقييم أداء الطرق الجزيئية مقارنة بتلك الموجودة للجزيئات الصغيرة والكبيرة. يصعب تطبيق العديد من المبادئ التوجيهية لمثل هذه الدراسات على الطرق الجزيئية بسبب التصميم الفريد والمعقد لكل من المنتجات والمقايسات نفسها ، مما يثير تساؤلات حول مدى ملاءمة المنصات المتاحة للتقييمات الموصى بها والطرق المناسبة للتحقق من صحة الفحص. حتى الآن ، لم تطلب إدارة الغذاء والدواء الأمريكية التحقق الرسمي من المقايسات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، على الرغم من أن وكالة الأدوية الأوروبية فرضت هذا المطلب17. في ضوء هذا الفراغ ، أصدرت مجموعات وورش عمل مختلفة أوراقا بيضاء وتوصيات سعى المصنعون ومنظمات البحوث التعاقدية إلى اتباعها18،19،20،21،22،23،24،25. تمت كتابة معظم هذه التوصيات على وجه التحديد مع وضع مقايسات qPCR في الاعتبار ، مع اقتراحات أو تعديلات للمنصات الناشئة ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات (ddPCR) ، المدرجة فقط حسب الاقتضاء. ركزت التوصيات الأحدث عهدا على اعتبارات مقايسات ddPCR ، لكنها ركزت إلى حد كبير على تطبيقاتها على القياس الكمي لجينوم المتجهات في بيئة التصنيع بدلا من المصفوفات البيولوجية المعقدة التي تمت مواجهتها في دراسات التكاثر البيولوجي.
اعتمادا على التطبيق السريري والأهداف ، قد يفضل ddPCR على qPCR لدعم دراسات التوزيع الحيوي والتساقط بسبب زيادة حساسية ddPCR وقدرته على التعامل مع تداخل المصفوفة مقارنة ب qPCR. علاوة على ذلك ، نظرا لتقسيم العينات إلى ما يقرب من 20000 قطرة ، يمكن تحقيق تقدير كمي دقيق لرقم النسخة دون استخدام منحنى قياسي باستخدام إحصائيات بواسون ، مما يبسط تطوير الطريقة والتحقق من صحتها. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف نهج موحد لتطوير والتحقق من صحة طريقة قائمة على ddPCR للكشف عن ناقلات AAV في الدموع التي تم جمعها من سطح العين لدعم دراسات التكاثر البيولوجي السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عدة خطوات لبروتوكول ddPCR ضرورية للأداء السليم للفحص. الخطوة الأولى الحاسمة هي تصميم وتحسين الاشعال والمسبار. بشكل عام ، يوصى باستخدام الكيمياء القائمة على مسبار التحلل المائي على الكيمياء القائمة على الصبغة (على سبيل المثال ، SYBR Green) في بيئة ما قبل السريرية أو السريرية نظرا لخصوصيتها الفائقة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد اختيار هدف التضخيم أمرا بالغ الأهمية. عادة ، يتم استهداف جين التحوير الذي يهم الناقل. ومع ذلك ، في المراحل قبل السريرية المبكرة أو في النواقل حيث قد لا يكون من الممكن التمييز بين جين التحوير الناقل مقابل الحمض النووي الجينومي ، قد يكون من المناسب استخدام أهداف النواقل الموحدة. على سبيل المثال ، يمكن للمرء أن يستهدف منطقة التكرار الطرفي المقلوب ، أو المروج ، أو ذيل poly-A ، أو التقاطعات بين الأجزاء بين مكونات المتجه هذه. سيختلف اختيار الهدف بناء على تصميم المتجه. عادة ما تكون استراتيجيات وبرامج تصميم البرايمر والمسبار qPCR التقليدية مناسبة ل ddPCR. يجب اختيار معلمات التصميم التي من المتوقع أن تسفر عن درجة حرارة تلدين ثابتة (على سبيل المثال ، 60 درجة مئوية) لتقليل مقدار التحسين المطلوب. كما تمت التوصية بتصميم وترتيب وتقييم ثلاث مجموعات مختلفة على الأقل لكل هدف. يجب على المرء بعد ذلك اختيار المجموعة التي تظهر أكبر قدر من الخصوصية (لا يوجد تضخيم في بئر التحكم السلبي أو في مصفوفة من الحمض النووي المستهدف ذي الصلة) والحساسية (أي حد الكشف)20.
إذا كان من المفيد أن تكون قادرا على نقل الفحص بين qPCR و ddPCR ، فمن المستحسن تحسين ظروف الفحص باستخدام qPCR أولا ، وتحديد شروط المجموعة المحددة التي تؤدي إلى كفاءة تضخيم بنسبة 90٪ -110٪ مع R2 ≥ 0.98. ومع ذلك ، فإن ddPCR كطريقة نقطة نهاية عادة ما تكون أقل حساسية من qPCR بسبب الاختلافات في كفاءات التضخيم. كحد أدنى ، يوصى بتشغيل تدرج درجة حرارة حراري في خطوة التلدين / التمديد لتغطية درجات الحرارة أعلى وأقل من درجات حرارة التلدين المتوقعة ولتقييم فصل سعة المطر والفلورسنت بين مجموعات القطرات السالبة والموجبة كدالة لدرجة الحرارة. إذا سمحت مساحة العمل ، فمن المستحسن أن يكون لديك محطات عمل فردية مخصصة لإعداد المزيج الرئيسي وإضافة القوالب والتضخيم. حيثما أمكن ، يجب فصلها ماديا عن طريق سير عمل أحادي الاتجاه مع ضوابط هندسية مدمجة ، مثل الوصول المتحكم فيه وضغوط الهواء التفاضلية ، لتقليل مخاطر التلوث المتبادل والإيجابيات الخاطئة. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فيجب توخي الحذر الشديد لمنع انتقال التلوث.
هناك خطوتان في هذا البروتوكول قد تبدوان غير عاديتين لأولئك الذين اعتادوا أكثر على تطوير مقايسة qPCR. الأول هو إدراج إنزيم تقييد في مزيج PCR الرئيسي. أثناء تضخيم ddPCR ، يتم تدوير كل قطرة بالحرارة إلى نقطة النهاية. في الفحص المحسن بشكل صحيح ، ينتج عن هذا مجموعتان من القطرات ، مجموعة واحدة تعرض مستوى مرتفعا باستمرار من إشارات الفلورسنت – الإيجابيات – وأخرى تعرض باستمرار مستوى منخفضا من إشارة الفلورسنت – السلبيات. في حالة حدوث تداخل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فقد يؤدي ذلك إلى إلغاء مزامنة بدء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يؤدي إلى عدم وصول القطرة إلى هضبة التضخيم ، وبالتالي نقاط نهاية الفلورسنت غير المتسقة. في هذه الحالة ، سيتم توزيع القطرات بين السلبيات والإيجابيات ، مما يؤدي إلى ظاهرة تسمى مطر ddPCR. ويمكن أن يؤدي ذلك إلى تقدير كمي غير دقيق للهدف وإلى عتبات مطبقة بشكل غير متسق وذاتي. توصيتنا بتعيين العتبة أعلى قليلا من إشارة NTC ، والتي يجب أن تقلل من آثار المطر في القياس الكمي النهائي حيث لا تزال جميع القطرات تعتبر إيجابية ، حتى لو لم يتم تدويرها بالكامل إلى نقطة النهاية. تحتوي AAVs على بنية ثانوية معقدة للغاية ، اعتمادا على هدف التضخيم ، قد تقلل من إمكانية الوصول إلى البادئات والمجسات ، مما يؤدي إلى تداخل تفاعل البوليميراز المتسلسل وبالتالي المطر. يؤدي إدراج إنزيم التقييد في المزيج الرئيسي إلى شق هذا الهيكل الثانوي لزيادة الوصول بواسطة البادئات والمجسات ، مما يقلل من المطر ، مما قد يحسن بالتالي دقة الفحص. تم وصف آثار إدراج إنزيم تقييد في تفاعل ddPCR سابقا25,32. يمكن استخدام أي إنزيم تقييد ، طالما تم التأكد من عدم قطعه داخل منطقة التضخيم المستهدفة. لا توجد خطوات ما قبل الهضم أو تركيبات عازلة بديلة مطلوبة.
الخطوة الثانية غير العادية هي إعداد عينة المسيل للدموع التي تحتوي على AAV. في هذا البروتوكول ، تم استخدام نسبة 1:10 (أو أكثر) من الدموع وبعد ذلك تم تسخين العينة. عادة ، عندما يتم جمع الدموع عبر أنبوب شعري ، وهي طريقة جمع مستخدمة على نطاق واسع ، في المتوسط يمكن جمع حوالي 10.0 ميكرولتر33. يساعد التخفيف على معالجة حجم العينة المحدود وتوفير مواد كافية لاختبار الآبار المكررة. في حين أن هذا يقلل من الحد النظري للكشف ، إلا أن الحساسية القوية ل ddPCR يجب أن تؤدي إلى اكتشاف جميع الجسيمات المتجهة باستثناء عدد قليل للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي هذا النهج إلى إنشاء بئر “نسخ احتياطي” إذا فشل أحدهم بشكل غير متوقع. في هذه الحالة ، أو في حالات عدم كفاية حجم العينة لتشغيل بئرين ، يمكن استخدام خطأ بواسون لتقييم الدقة. علاوة على ذلك ، في الحالات التي يكون فيها التركيز أقل من حد الكشف ، فإنه يخلق فرصة لدمج بيانات البئر لتحديد التركيز. من الضروري تحرير ناقلات AAV من القفيصات الفيروسية للكشف عن ddPCR. تضمنت بعض طرق القياس الكمي ل AAV خطوة هضم البروتيناز K لإزالة القفيصة الفيروسية34،35،36. جميع الأنماط المصلية AAV التي تحدث بشكل طبيعي لها درجات حرارة انصهار عند أو أقل من حوالي 90 درجة مئوية ، مع انخفاض معظمها إلى أقل من 80 درجة مئوية. لذلك ، يبدو أن هذا إدراج غير ضروري37. يبدو أن التسخين وحده كاف لإطلاق الحمض النووي المتجه.
علاوة على ذلك ، يكون ddPCR بشكل عام أقل عرضة لمثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي قد تكون موجودة في عينة قد تؤثر على مقايسة qPCR. إذا تم تضمين خطوة عزل الحمض النووي المحددة ، فسيتطلب ذلك أيضا التحقق من الصحة المحددة ، والتي يتم تجنبها في هذا البروتوكول. يتم تخفيف العينات قبل التسخين بسبب حركية انتشار جينومات الناقل في السائل. أثناء عملية التسخين والتبريد اللاحقة ، يمكن أن تلتصق خيوط الحس الإيجابي والسلبي لجينوم الحمض النووي أحادي الشريط معا لإنتاج وسيط مزدوج الشريط إذا كانت التركيزات عالية بما فيه الكفاية. يقلل التخفيف قبل التسخين من التركيزات ويجعل من غير المحتمل رياضيا أن يتشكل ما يكفي من المواد الوسيطة المزدوجة التي تقطعت بها السبل ليكون لها تأثير سلبي على دقة القياس الكمي. وتجدر الإشارة إلى أن شظايا الحمض النووي الاصطناعية أو البلازميدات الخطية المستخدمة كضوابط للجودة يجب ألا تخضع لخطوة التسخين هذه. نظرا لأن هذه مزدوجة الخيوط ، فإن التسخين سيؤدي إلى التحويل إلى مواد وسيطة مفردة تقطعت بها السبل. بعد التقسيم المستقل لهذه QCs التي تقطعت بها السبل إلى قطرات ، من المتوقع أن يؤدي ذلك إلى زيادة مضاعفة في تركيز مراقبة الجودة بالنسبة للتركيز الاسمي. بدلا من ذلك ، إذا كان سيتم تسخين QCs لتوحيد الطريقة ، فيجب أخذ ذلك في الاعتبار في إعادة تكوين وتخصيص تركيز اسمي.
أخيرا ، فيما يتعلق بإعداد العينة ، توصي العديد من البروتوكولات أيضا بإدراج خطوة معالجة DNase لإزالة أي حمض نووي ناقل غير مغلف. هذه الخطوة حاسمة في الحالات التي لا يرغب فيها في تحديد كمية الحمض النووي الحر المرتبط بإعداد الناقل (مثل أثناء القياس الكمي لأغراض الجرعة). ومع ذلك ، في سياق دراسات التوزيع البيولوجي والتحليل البيولوجي ، يرغب المرء عادة في معرفة أين سافر أي حمض نووي متجه ، بغض النظر عما إذا كان مغلفا أم لا. لذلك ، يقترح عدم إجراء خطوة علاج DNase أثناء هذه الدراسات. إذا تقرر أنه من الضروري تضمين خطوة DNase ، فيجب أن تكون هذه الخطوة قبل التخفيفات والتسخين.
في هذه الورقة ، يتم تقديم بيانات تمثل نهج تقييم النطاق الديناميكي والحساسية والدقة والدقة للطريقة في سياق التحقق المناسب للغرض والمتوافق مع الممارسات المختبرية الجيدة. إن النقص الحالي في التوجيه حول هذا الموضوع يترك مختبرات التحقق من الصحة لتحديد معايير الفحص المستهدفة لأنفسهم ، بما يتماشى مع تفكير الصناعة الحالي. طرحت مجموعات مختلفة معايير مستهدفة أعلى وأقل مما هو مستخدم في هذه الدراسة19،20،21،22،23،24،25. يجب اختيار معايير الفحص المستهدفة ، حتى يتم تحديدها بشكل أكثر صرامة ، قبل التحقق من الصحة بناء على التطبيقات السريرية المقصودة للطريقة. اعتمادا على القرارات النهائية التي يتعين اتخاذها على أساس البيانات ، قد تكون هناك حاجة إلى مستويات أعلى من الدقة والدقة. على العكس من ذلك ، قد تكون النتيجة الإيجابية البسيطة مقابل النتيجة السلبية كافية.
وتناول النهج أيضا توصيات لتقييم الخصوصية وتأثير المصفوفة. فشلت مجموعة من الدموع التي تم جمعها من الأفراد غير المعالجين في تحقيق نتيجة إيجابية في هذا الفحص ، في حين يمكن اكتشاف الهدف عندما تم رفع الناقل في الدموع بتركيز عال ومنخفض ضمن معدلات الشفاء الموصى بها. ومن الناحية المثالية، ستدرج في هذه التقييمات أيضا مصفوفة تحتوي على ناقل داخلي المنشأ (على سبيل المثال، تجمع بعد العلاج بالناقل الفيروسي). ومع ذلك ، فمن غير المحتمل أن تكون هذه العينات متاحة للاستخدام في التحقق من الصحة. لزيادة قوة التحقق من الصحة ، يمكن تقييم مجموعات متعددة من الدموع ، أو الدموع التي تم جمعها من مجموعة متنوعة من الأفراد ، لتحديد ما إذا كان تأثير المصفوفة الخاص بالمريض يحدث. أخيرا ، يوصى بتقييم الاستقرار. في سير العمل حيث يحدث استخراج الحمض النووي خارج المصفوفة الحيوية ، قد يكون من الضروري تقييم استقرار كل من العينة والحمض النووي المستخرج. في سير العمل هذا ، يتم اختبار العينة مباشرة في الفحص دون الحاجة إلى استخراج الحمض النووي. لذلك ، بالنظر إلى تقييم الاستقرار لهذه الطريقة ، يجب على المرء تقييم استقرار عينات الدموع. عادة ، يوصى بتقييمات الطاولة والثلاجة والتجميد / الذوبان وتقييمات الاستقرار طويلة الأجل. لم يتم إجراء هذه كجزء من هذه الدراسة ، ولكن يمكن استخدام الأساليب التي تم تطويرها هنا في هذا التقييم ، بعد التلاعب بعينات المدخلات.
بشكل عام ، ثبت أن هذه الطريقة هي اختبار قوي وقابل للتكرار ويمكن التحقق من صحته للكشف عن النواقل القائمة على AAV في عينات الدموع. ويمكن أن يكون بمثابة منصة لتكييفها مع نواقل محددة لدعم التجارب السريرية ويوفر أساسا للتحقق من صحة الفحص بما يتفق مع الممارسات المختبرية الجيدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر راسل وبراندون ماكيثان من Bio-Rad على مناقشاتهم المفيدة أثناء تطوير هذه الطريقة.
Materials
| AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
| AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
| DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
| PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
| Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
| Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
| Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
| Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
| TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
| Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |
References
- Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. Is it ‘gene therapy. Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).
- Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update. The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).
- Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
- Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy Available from: https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx (2022)
- Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products (2022)
- Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).
- Lundstrom, K. Viral vectors in gene therapy. Diseases. 6 (2), 42 (2018).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31, 317-334 (2017).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug (2020)
- Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products (2020)
- Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during (2020)
- Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy (2016)
- Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency Available from: https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy (2023)
- Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders (2020)
- Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products (2015)
- Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf (2018)
- Kaur, S. white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A – recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B – regulatory agencies’ inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine). Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).
- Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories. The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).
- Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).
- Wissel, M. Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC. Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).
- Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme Available from: https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf (2018)
- Pinheiro, L., Emslie, K. R. Basic concepts and validation of digital PCR measurements. Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).
- Tzonev, S. Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean. Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).
- Prantner, A., Marr, D. Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR. PLoS One. 18, 0280242 (2023).
- Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/ (2023)
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer 3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Ye, J. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf (2023)
- Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Basu, A. Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR. SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).
- Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
- Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11, 10064 (2021).
- Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR. Genes. 12 (4), 601 (2021).
- Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate. Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Bennett, A., et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).
