Qui, presentiamo un protocollo per lo sviluppo e la convalida di buone pratiche di laboratorio nella rilevazione conforme di vettori virali adeno-associati in lacrime umane mediante reazione a catena della polimerasi digitale a supporto dello sviluppo clinico di vettori di terapia genica.
L’uso di vettori virali per il trattamento di malattie genetiche è aumentato notevolmente negli ultimi anni, con oltre 2.000 studi registrati fino ad oggi. I vettori virali adeno-associati (AAV) hanno riscontrato particolare successo nel trattamento delle malattie correlate agli occhi, come esemplificato dall’approvazione di voretigene neparvovec-rzyl. Per portare nuove terapie sul mercato, le agenzie regolatorie in genere richiedono studi di bioshedding qualificati o convalidati per valutare il rilascio del vettore nell’ambiente. Tuttavia, nessuna linea guida ufficiale per lo sviluppo di saggi a base molecolare a supporto di tali studi di spargimento è stata rilasciata dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti, lasciando agli sviluppatori di determinare le migliori pratiche per se stessi. Lo scopo di questo protocollo è quello di presentare un protocollo validabile per la rilevazione di vettori AAV in lacrime umane mediante reazione a catena della polimerasi digitale a goccia (ddPCR) a supporto di studi clinici di bioshedding. Questo manoscritto discute gli attuali approcci industriali alla convalida dei saggi molecolari e dimostra che il metodo supera i criteri di accettazione del test target attualmente proposti nei white paper. Infine, vengono discussi i passaggi critici nell’esecuzione di qualsiasi test ddPCR, indipendentemente dall’applicazione.
Le definizioni di terapia genica variano, ma generalmente inducono un’alternanza permanente intenzionale e spesso prevista di una specifica sequenza di DNA del genoma cellulare per modificare o manipolare l’espressione di un gene o alterare le proprietà biologiche di una cellula vivente per uno scopo clinico 1,2. I vettori virali sono sempre più utilizzati come veicoli per la terapia genica a causa della loro efficienza di trasduzione, con un rapporto che suggerisce che oltre il 70% degli attuali studi clinici di terapia genica utilizza vettori virali3. L’interesse per i vettori virali per la terapia genica è in costante aumento. Il Quarter 4 2022 Quarterly Data Report on the Gene, Cell, and RNA therapy dell’American Society of Gene and Cell Therapy ha riportato che nel 2022 la pipeline di terapia genica, cellulare e RNA dalla preclinica alla pre-registrazione è cresciuta del 7%, portando il numero totale di terapie in fase di sviluppo a 3.726, di cui 2.053 (55%) erano terapie geniche4. La Food and Drug Administration degli Stati Uniti (USA FDA) ha attualmente approvato 27 terapie cellulari e geniche per uso clinico negli esseri umani, cinque delle quali utilizzano specificamente vettori virali5.
I virus adeno-associati (AAV) hanno guadagnato un interesse specifico come veicoli per la terapia genica. Una recente meta-analisi ha rivelato che ci sono stati circa 136 studi clinici che hanno studiato l’uso di AAV negli ultimi due decenni6. Inoltre, tre delle cinque terapie geniche approvate dalla FDA USA sono basate su AAV. Ciò è dovuto alla loro natura altamente modificabile, all’ampia gamma di ospiti che possono essere regolati in base all’uso di specifici vettori naturali o artificiali, alla bassa patogenicità e tossicità nell’uomo e generalmente alla bassa immunogenicità 7,8. Gli AAV sono stati anche utilizzati con successo per trattare le malattie oculari in un ambiente clinico approvato. Voretigene neparvovec-rzyl è una terapia a base di AAV2 approvata dalla FDA statunitense nel 2017 e dall’Agenzia europea per i medicinali (EMA) nel 2018 per il trattamento della distrofia retinica associata alla mutazione biallelica RPE65 9.
Con il crescente interesse per lo sviluppo di terapie basate su AAV arriva la necessità di linee guida normative sui saggi. Il rilevamento e la quantificazione accurati di qualsiasi vettore virale sono parte integrante delle fasi di scoperta, produzione e test preclinico/clinico dello sviluppo del prodotto. La FDA statunitense ha iniziato a pubblicare alcune linee guida per le terapie geniche, tra cui la chimica, la produzione e il controllo per le applicazioni sperimentali di nuovi farmaci per la terapia genica umana10, il follow-up a lungo termine dopo la somministrazione della terapia genica 11, i test retrovirus competenti per la replicazione 12 e le raccomandazioni per i vettori microbici utilizzati nelle terapie geniche 13. L’EMA ha anche pubblicato una serie di linee guida riguardanti lo sviluppo di prodotti di terapia genica che generalmente si allineano con le raccomandazioni della FDA, sebbene esistano alcune differenze14. È importante notare che, sebbene queste linee guida non stabiliscano responsabilità legalmente applicabili, tranne quando si fa riferimento a normative specifiche, forniscono chiarezza sull’attuale pensiero delle agenzie di regolamentazione sull’argomento e le loro aspettative per i test richiesti per i depositi di farmaci e l’approvazione normativa.
La FDA raccomanda specificamente che siano condotti studi per valutare la distribuzione, la persistenza e la clearance di un vettore dal sito di somministrazione per colpire i tessuti oculari e non oculari, i fluidi intraoculari e il sangue15. Questi assumono la forma di studi di biodistribuzione e spargimento. Gli studi di biodistribuzione valutano l’esposizione studiando come un prodotto si diffonde in tutto il corpo di un paziente dal sito di somministrazione. Lo spargimento valuta specificamente il rilascio del prodotto dal paziente nell’ambiente e aumenta la possibilità di trasmissione del vettore a individui non trattati16. La FDA formula raccomandazioni per la progettazione di studi di biodistribuzione e spargimento per quanto riguarda la frequenza della raccolta dei campioni, la durata della raccolta dei campioni, i tipi di campioni raccolti e le condizioni di conservazione.
Inoltre, la FDA raccomanda l’uso della reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR o real-time PCR) per la rilevazione quantitativa dei genomi vettoriali grazie alla sua facilità di prestazioni, al formato ad alta produttività, ai rapidi tempi di consegna e alla sensibilità del test. Tuttavia, vi è una relativa mancanza di raccomandazioni per la progettazione e la valutazione delle prestazioni dei metodi molecolari rispetto a quelli esistenti per le molecole piccole e grandi. Molte delle linee guida per tali studi sono difficili da applicare ai metodi molecolari a causa della progettazione unica e complessa sia dei prodotti che dei saggi stessi, sollevando dubbi sull’adeguatezza delle piattaforme disponibili per le valutazioni raccomandate e dei metodi appropriati per la convalida dei saggi. Ad oggi, la FDA non ha richiesto la convalida formale dei test basati sulla PCR, sebbene l’EMA abbia imposto questo requisito17. Alla luce di questo vuoto, diversi gruppi e workshop hanno pubblicato white paper e raccomandazioni che i produttori e le organizzazioni di ricerca a contratto hanno cercato di seguire 18,19,20,21,22,23,24,25. La maggior parte di queste raccomandazioni sono scritte specificamente con saggi qPCR in mente, con suggerimenti o modifiche per piattaforme emergenti, come droplet digital PCR (ddPCR), inclusi solo se ritenuto rilevante. Le raccomandazioni più recenti si sono concentrate sulle considerazioni per i saggi ddPCR, ma si sono in gran parte concentrate sulle loro applicazioni alla quantificazione del genoma vettoriale in un ambiente di produzione piuttosto che nelle complesse matrici biologiche incontrate negli studi di bioshedding.
A seconda dell’applicazione clinica e degli obiettivi, la ddPCR può essere preferita alla qPCR a supporto degli studi di biodistribuzione e spargimento a causa della maggiore sensibilità e capacità di gestire l’interferenza della matrice rispetto alla qPCR. Inoltre, grazie alla suddivisione dei campioni in circa 20.000 goccioline, è possibile ottenere una quantificazione accurata del numero di copie senza l’uso di una curva standard utilizzando la statistica di Poisson, semplificando lo sviluppo e la convalida del metodo. L’obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un approccio standardizzato per lo sviluppo e la validazione di un metodo basato su ddPCR per la rilevazione di vettori AAV in lacrime raccolte dalla superficie oculare a supporto di studi clinici di bioshedding.
Ci sono diversi passaggi del protocollo ddPCR che sono fondamentali per la corretta esecuzione del test. Il primo passo critico è la progettazione e l’ottimizzazione dei primer e della sonda. In generale, l’uso della chimica basata sulla sonda di idrolisi rispetto alla chimica a base di coloranti (ad esempio, SYBR Green) in un contesto preclinico o clinico è raccomandato a causa della loro specificità superiore. Inoltre, la scelta del target di amplificazione è critica. Tipicamente, il transgene di interesse del vettore è mirato. Tuttavia, in fasi precliniche precedenti o in vettori in cui potrebbe non essere possibile distinguere il transgene vettoriale rispetto al DNA genomico, può essere appropriato utilizzare bersagli vettoriali standardizzati. Ad esempio, si potrebbe prendere di mira la regione di ripetizione terminale invertita, il promotore, la coda poli-A o le giunzioni inter-segmento tra questi componenti vettoriali. La scelta del target varierà in base al design vettoriale. Le tradizionali strategie e software di progettazione di primer e sonda qPCR sono in genere appropriati per la ddPCR. I parametri di progettazione che dovrebbero produrre una temperatura di ricottura costante (ad esempio, 60 °C) devono essere selezionati per ridurre la quantità di ottimizzazione richiesta. È stato inoltre raccomandato di progettare, ordinare e valutare almeno tre diversi set per ciascun target. Si dovrebbe quindi selezionare il set che mostra la maggiore specificità (nessuna amplificazione nel pozzo di controllo negativo o in una matrice di DNA bersaglio correlato) e sensibilità (cioè limite di rilevazione)20.
Se è vantaggioso essere in grado di trasferire il test tra qPCR e ddPCR, si raccomanda di ottimizzare prima le condizioni del test utilizzando qPCR e di identificare le condizioni per il set selezionato che si traducono in efficienze di amplificazione del 90% -110% con un R2 ≥ 0,98. Tuttavia, la ddPCR come metodo endpoint è tipicamente meno sensibile della qPCR a causa delle variazioni nelle efficienze di amplificazione. Come minimo, si raccomanda di eseguire un gradiente di temperatura termica nella fase di ricottura/estensione per coprire temperature superiori e inferiori alle temperature di ricottura previste e di valutare la separazione dell’ampiezza della pioggia e della fluorescenza tra i cluster di goccioline negativi e positivi in funzione della temperatura. Se l’area di lavoro lo consente, si consiglia di disporre di singole workstation dedicate per la preparazione del master mix, l’aggiunta di modelli e l’amplificazione. Ove possibile, questi dovrebbero essere fisicamente separati da un flusso di lavoro unidirezionale con controlli tecnici integrati, come l’accesso controllato e le pressioni dell’aria differenziale, per ridurre il rischio di contaminazione incrociata e falsi positivi. Se ciò non è possibile, è necessario prestare estrema attenzione per prevenire la contaminazione incrociata.
Ci sono due passaggi in questo protocollo che possono sembrare insoliti per coloro che sono più abituati allo sviluppo del test qPCR. Il primo è l’inclusione di un enzima di restrizione nel master mix PCR. Durante l’amplificazione ddPCR, ogni goccia viene termociclizzata all’endpoint. In un test opportunamente ottimizzato, ciò si traduce in due popolazioni di goccioline, una serie che mostra un livello costantemente elevato di segnali fluorescenti – i positivi – e un altro che mostra costantemente un basso livello di segnale fluorescente – i negativi. Se si verifica un’interferenza PCR, può desincronizzare l’inizio dell’amplificazione PCR, con il risultato che la goccia non raggiunge un plateau di amplificazione e quindi endpoint fluorescenti incoerenti. In questo caso, le goccioline saranno distribuite tra negativi e positivi, risultando in un fenomeno chiamato pioggia ddPCR. Ciò può comportare una quantificazione imprecisa dell’obiettivo e soglie applicate in modo incoerente e soggettivo. La nostra raccomandazione di impostare la soglia leggermente al di sopra del segnale del NTC, che dovrebbe ridurre al minimo gli effetti della pioggia nella quantificazione finale poiché tutte le goccioline sono ancora considerate positive, anche se non completamente ciclizzate all’endpoint. Gli AAV hanno una struttura secondaria altamente complessa che, a seconda del target di amplificazione, può ridurre l’accessibilità ai primer e alle sonde, con conseguente interferenza PCR e quindi pioggia. L’inclusione dell’enzima di restrizione nella miscela principale fende questa struttura secondaria per aumentare l’accesso da parte dei primer e delle sonde, riducendo la pioggia, che può quindi migliorare l’accuratezza del test. Gli effetti dell’inclusione di un enzima di restrizione nella reazione ddPCR sono stati descritti in precedenza 25,32. Qualsiasi enzima di restrizione può essere utilizzato, purché sia confermato che non taglia all’interno della regione di amplificazione target. Non sono necessari passaggi di predigestione o composizioni tampone alternative.
Il secondo passo insolito è la preparazione del campione lacrimale contenente AAV. In questo protocollo, è stato utilizzato un rapporto 1:10 (o superiore) di lacrime e successivamente il campione è stato riscaldato. Tipicamente, quando le lacrime vengono raccolte attraverso un tubo capillare, che è un metodo di raccolta ampiamente utilizzato, in media circa 10,0 μL possono essere raccolti33. La diluizione aiuta a risolvere il volume limitato del campione e fornisce materiale sufficiente per i test dei pozzi duplicati. Mentre questo riduce il limite teorico di rilevazione, la robusta sensibilità della ddPCR dovrebbe comunque portare alla rilevazione di tutte le particelle vettoriali tranne un numero estremamente esiguo. Questo approccio crea inoltre un pozzo di “backup” se uno dovesse fallire inaspettatamente. In questo caso, o in caso di volume di campione insufficiente per far funzionare due pozzi, l’errore di Poisson potrebbe essere utilizzato per valutare la precisione. Inoltre, nei casi in cui la concentrazione è inferiore al limite di rilevamento, crea l’opportunità di unire i dati dei pozzi per determinare una concentrazione. È necessario liberare i vettori AAV dai capsidi virali per il rilevamento della ddPCR. Alcuni metodi per la quantificazione dell’AAV hanno incluso una fase di digestione della proteinasi K per rimuovere il capside virale34,35,36. Tutti i sierotipi AAV presenti in natura hanno temperature di fusione pari o inferiori a circa 90 °C, con la maggior parte che scende al di sotto di 80 °C; Pertanto, questa sembra essere un’inclusione non necessaria37. Il riscaldamento da solo sembra essere sufficiente per rilasciare DNA vettore.
Inoltre, la ddPCR è generalmente meno suscettibile agli inibitori della PCR che possono essere presenti in un campione che può influenzare un test qPCR. Se viene inclusa una specifica fase di isolamento del DNA, ciò richiederebbe anche una convalida specifica, che viene evitata in questo protocollo. I campioni vengono diluiti prima del riscaldamento a causa della cinetica di diffusione dei genomi vettori in un liquido. Durante il processo di riscaldamento e successivo raffreddamento, i filamenti di senso positivi e negativi del genoma del DNA a singolo filamento possono ricottura insieme per produrre un intermedio a doppio filamento se le concentrazioni sono sufficientemente elevate. La diluizione prima del riscaldamento riduce le concentrazioni e rende matematicamente improbabile che si formino abbastanza intermedi a doppio filamento da avere un effetto negativo sull’accuratezza della quantificazione. Va notato che i frammenti di DNA sintetico o i plasmidi linearizzati utilizzati come controlli di qualità non devono essere sottoposti a questa fase di riscaldamento. Poiché si tratta di due filamenti, il riscaldamento comporterebbe la conversione in intermedi a singolo filamento. A seguito della suddivisione indipendente di questi QC a singolo filamento in goccioline, ciò dovrebbe comportare un aumento doppio della concentrazione di QC rispetto alla concentrazione nominale. In alternativa, se i QC devono essere riscaldati per standardizzare il metodo, questo deve essere preso in considerazione nella ricostituzione e nell’assegnazione di una concentrazione nominale.
Infine, per quanto riguarda la preparazione del campione, molti protocolli raccomandano anche l’inclusione di una fase di trattamento della DNasi per rimuovere qualsiasi DNA vettoriale non capsidata. Questo passaggio è fondamentale nei casi in cui non si desidera quantificare il DNA libero associato alla preparazione del vettore (come durante la quantificazione ai fini del dosaggio). Tuttavia, nel contesto degli studi di biodistribuzione e bioshedding, in genere si desidera sapere dove ha viaggiato il DNA di un vettore, indipendentemente dal fatto che sia incapsulato o meno. Pertanto, si suggerisce di non eseguire in genere una fase di trattamento della DNasi durante tali studi. Se si ritiene necessario includere una fase DNase, questa fase deve essere prima delle diluizioni e del riscaldamento.
In questo articolo vengono presentati dati rappresentativi dell’approccio alla valutazione della gamma dinamica, della sensibilità, dell’accuratezza e della precisione del metodo nel contesto di una convalida conforme alle buone pratiche di laboratorio adatte allo scopo. L’attuale mancanza di linee guida su questo argomento lascia che i laboratori di convalida determinino i criteri di analisi target per se stessi, in linea con l’attuale pensiero del settore. Diversi gruppi hanno posto criteri target sia più alti che più bassi rispetto a quelli utilizzati in questo studio 19,20,21,22,23,24,25. I criteri di analisi target, fino a quando non saranno definiti in modo più rigido, devono essere selezionati prima della convalida in base alle applicazioni cliniche previste del metodo. A seconda delle decisioni a valle da prendere sulla base dei dati, potrebbero essere necessari livelli più elevati di accuratezza e precisione. Al contrario, un semplice risultato positivo contro negativo può essere sufficiente.
L’approccio ha anche affrontato raccomandazioni per la valutazione della specificità e di un effetto matrice. Un pool di lacrime raccolte da individui non trattati non è riuscito a produrre un risultato positivo in questo test, mentre il bersaglio poteva essere rilevato quando il vettore è stato inserito nelle lacrime ad una concentrazione alta e bassa entro i tassi di recupero raccomandati. Idealmente, anche la matrice contenente vettore endogeno (ad esempio, raccolta dopo il trattamento con vettore virale) dovrebbe essere inclusa in queste valutazioni. Tuttavia, è improbabile che tali campioni siano disponibili per l’uso in una convalida. Per aumentare la robustezza della convalida, è stato possibile valutare più pool di lacrime, o lacrime raccolte da una varietà di individui, per determinare se si verifica un effetto della matrice specifico del paziente. Infine, si raccomanda di valutare la stabilità. Nei flussi di lavoro in cui l’estrazione del DNA avviene al di fuori della matrice biologica, può essere necessario valutare la stabilità sia del campione che del DNA estratto. In questo flusso di lavoro, il campione viene testato direttamente nel test senza la necessità di estrarre il DNA. Pertanto, in considerazione della valutazione della stabilità per questo metodo, è necessario valutare la stabilità dei campioni lacrimali. In genere, si raccomandano valutazioni di stabilità da banco, frigorifero, congelamento / disgelo e a lungo termine. Questi non sono stati eseguiti come parte di questo studio, ma i metodi sviluppati qui possono essere utilizzati in questa valutazione, a seguito di manipolazioni ai campioni di input.
Nel complesso, questo metodo ha dimostrato di essere un test robusto, ripetibile e validabile per rilevare vettori basati su AAV in campioni lacrimali. Può servire come piattaforma da adattare a vettori specifici per supportare le sperimentazioni cliniche e fornisce una base per la convalida di un test coerente con le buone pratiche di laboratorio.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Nick Russell e Brandon McKethan di Bio-Rad per le loro utili discussioni durante lo sviluppo di questo metodo.
AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |