Ein validierbarer digitaler Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktions-Assay für den Nachweis von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in Bioshedding-Studien an Tränen
Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Validierung guter Laborpraktiken bei der konformen Detektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in menschlichen Tränen durch digitale Polymerase-Tröpfchenkettenreaktion zur Unterstützung der klinischen Entwicklung von Gentherapievektoren vor.
Abstract
Der Einsatz von viralen Vektoren zur Behandlung genetischer Krankheiten hat in den letzten Jahren erheblich zugenommen, mit bisher über 2.000 registrierten Studien. Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren haben besondere Erfolge bei der Behandlung von Augenerkrankungen erzielt, wie die Zulassung von Voretigene Neparvovec-rzyl zeigt. Um neue Therapien auf den Markt zu bringen, verlangen die Zulassungsbehörden in der Regel qualifizierte oder validierte Bioshedding-Studien, um die Freisetzung des Vektors in die Umwelt zu bewerten. Die United States Food and Drug Administration hat jedoch keine offiziellen Richtlinien für die Entwicklung molekularer Assays zur Unterstützung solcher Shedding-Studien veröffentlicht, so dass die Entwickler die Best Practices für sich selbst bestimmen müssen. Ziel dieses Protokolls ist es, ein validierbares Protokoll für den Nachweis von AAV-Vektoren in menschlichen Tränen mittels digitaler Polymerase-Kettenreaktion (ddPCR) zur Unterstützung klinischer Bioshedding-Studien zu präsentieren. Dieses Manuskript diskutiert aktuelle Industrieansätze zur Validierung molekularer Assays und zeigt, dass die Methode die derzeit in White Papers vorgeschlagenen Akzeptanzkriterien für Zielassays übertrifft. Abschließend werden Schritte erörtert, die für die Durchführung eines ddPCR-Assays entscheidend sind, unabhängig von der Anwendung.
Introduction
Die Definitionen der Gentherapie variieren, induzieren aber im Allgemeinen eine absichtliche und oft erwartete dauerhafte Veränderung einer bestimmten DNA-Sequenz des zellulären Genoms, um die Expression eines Gens zu modifizieren oder zu manipulieren oder die biologischen Eigenschaften einer lebenden Zelle für einen klinischen Zweck zu verändern 1,2. Virale Vektoren werden aufgrund ihrer Transduktionseffizienz zunehmend als Vehikel für die Gentherapie verwendet, wobei ein Bericht darauf hindeutet, dass über 70 % der aktuellen klinischen Studien zur Gentherapie virale Vektoren verwenden3. Das Interesse an viralen Vektoren für die Gentherapie nimmt stetig zu. Der vierteljährliche Datenbericht der American Society of Gene and Cell Therapy für das 4. Quartal 2022 über die Gen-, Zell- und RNA-Therapielandschaft berichtet, dass im Jahr 2022 die Gen-, Zell- und RNA-Therapie-Pipeline von der Präklinik bis zur Vorregistrierung um 7 % gewachsen ist, womit sich die Gesamtzahl der in der Entwicklung befindlichen Therapien auf 3.726 erhöht, von denen 2.053 (55 %) Gentherapien waren4. Die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) hat derzeit 27 Zell- und Gentherapien für die klinische Anwendung beim Menschen zugelassen, von denen fünf speziell virale Vektoren verwenden5.
Adeno-assoziierte Viren (AAVs) haben als Vehikel für die Gentherapie besonderes Interesse geweckt. Eine kürzlich durchgeführte Metaanalyse ergab, dass es in den letzten zwei Jahrzehnten etwa 136 klinische Studien gab, in denen die Verwendung von AAVs untersucht wurde6. Darüber hinaus basieren drei der fünf von der FDA in den USA zugelassenen Gentherapien auf AAV-Basis. Dies liegt an ihrer hochgradig editierbaren Natur, ihrem breiten Wirtsspektrum, das auf der Grundlage der Verwendung spezifischer natürlich vorkommender oder künstlich hergestellter Vektoren abgestimmt werden kann, ihrer geringen Pathogenität und Toxizität beim Menschen und ihrer allgemein geringen Immunogenität 7,8. AAVs wurden auch erfolgreich zur Behandlung von Augenerkrankungen in einem zugelassenen klinischen Umfeld eingesetzt. Voretigene Neparvovec-rzyl ist eine AAV2-basierte Therapie, die 2017 von der US-amerikanischen FDA und 2018 von der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) zur Behandlung der mit der ballelischen RPE65-Mutation assoziierten Netzhautdystrophie zugelassen wurde9.
Mit dem zunehmenden Interesse an der Entwicklung von AAV-basierten Therapien steigt auch der Bedarf an regulatorischen Leitlinien für Assays. Der genaue Nachweis und die Quantifizierung eines viralen Vektors ist ein integraler Bestandteil der Entdeckungs-, Herstellungs- und präklinischen/klinischen Testphasen der Produktentwicklung. Die US-amerikanische FDA hat damit begonnen, einige Leitlinien für Gentherapien herauszugeben, darunter zur Chemie, Herstellung und Kontrolle von Anträgen auf neue Arzneimittel für die menschliche Gentherapie10, zur Langzeitnachsorge nach Verabreichung einer Gentherapie 11, zu replikationskompetenten Retrovirustests 12 und zu Empfehlungen für mikrobielle Vektoren, die in Gentherapien verwendet werden 13. Die EMA hat auch eine Reihe von Richtlinien für die Entwicklung von Gentherapieprodukten veröffentlicht, die im Allgemeinen mit den Empfehlungen der FDA übereinstimmen, obwohl einige Unterschiede bestehen14. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Leitlinien zwar keine rechtlich durchsetzbaren Verantwortlichkeiten festlegen, es sei denn, es wird auf spezifische Vorschriften verwiesen, aber sie schaffen Klarheit über die aktuelle Denkweise der Aufsichtsbehörden zu diesem Thema und ihre Erwartungen an Assays, die für Arzneimittelanträge und behördliche Zulassungen erforderlich sind.
Die FDA empfiehlt ausdrücklich, dass Studien durchgeführt werden sollten, um die Verteilung, Persistenz und Clearance eines Vektors vom Verabreichungsort auf okuläres und nicht-okuläres Gewebe, intraokulare Flüssigkeiten und Blut zu bewerten15. Diese finden in Form von Bioverteilungs- und Häutungsstudien statt. Biodistributionsstudien bewerten die Exposition, indem sie untersuchen, wie sich ein Produkt vom Verabreichungsort aus im Körper eines Patienten verteilt. Bei der Ausscheidung wird speziell die Freisetzung des Produkts vom Patienten in die Umwelt bewertet und die Möglichkeit einer Übertragung des Vektors auf unbehandelte Personen erhöht16. Die FDA gibt Empfehlungen für das Design von Bioverteilungs- und Shedding-Studien in Bezug auf die Häufigkeit der Probenentnahme, die Dauer der Probenentnahme, die Art der entnommenen Proben und die Lagerbedingungen.
Darüber hinaus empfiehlt die FDA die Verwendung der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR oder Real-Time-PCR) für den quantitativen Nachweis von Vektorgenomen aufgrund ihrer einfachen Leistung, ihres Hochdurchsatzformats, ihrer schnellen Durchlaufzeiten und ihrer Assay-Sensitivität. Es gibt jedoch einen relativen Mangel an Empfehlungen für das Design und die Leistungsbewertung molekularer Methoden im Vergleich zu denen, die für kleine und große Moleküle existieren. Viele der Leitlinien für solche Studien lassen sich aufgrund des einzigartigen und komplexen Designs sowohl der Produkte als auch der Assays selbst nur schwer auf molekulare Methoden anwenden, was die Frage nach der Eignung der verfügbaren Plattformen für die empfohlenen Bewertungen und geeigneten Methoden für die Assay-Validierung aufwirft. Bisher hat die FDA keine formale Validierung von PCR-basierten Assays verlangt, obwohl die EMA diese Anforderung auferlegt hat17. Angesichts dieser Lücke haben verschiedene Gruppen und Workshops Whitepaper und Empfehlungen herausgegeben, die Hersteller und Auftragsforschungsinstitute zu befolgen versucht haben 18,19,20,21,22,23,24,25. Die meisten dieser Empfehlungen wurden speziell für qPCR-Assays verfasst, wobei Vorschläge oder Änderungen für neue Plattformen, wie z. B. die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), nur dann aufgenommen werden, wenn dies als relevant erachtet wird. Neuere Empfehlungen konzentrierten sich auf Überlegungen zu ddPCR-Assays, konzentrierten sich jedoch weitgehend auf deren Anwendungen zur Quantifizierung des Vektorgenoms in einer Produktionsumgebung und nicht auf die komplexen biologischen Matrices, die in Bioshedding-Studien angetroffen werden.
Abhängig von der klinischen Anwendung und den Zielen kann die ddPCR der qPCR zur Unterstützung von Bioverteilungs- und Shedding-Studien vorgezogen werden, da die ddPCR im Vergleich zur qPCR eine höhere Sensitivität und Fähigkeit zur Behandlung von Matrixinterferenzen aufweist. Darüber hinaus kann durch die Aufteilung der Proben in ca. 20.000 Tröpfchen eine genaue Quantifizierung der Kopienzahl ohne die Verwendung einer Standardkurve unter Verwendung der Poisson-Statistik erreicht werden, was die Methodenentwicklung und -validierung vereinfacht. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten Ansatz für die Entwicklung und Validierung einer ddPCR-basierten Methode zum Nachweis von AAV-Vektoren in Tränen zu beschreiben, die von der Augenoberfläche gesammelt wurden, um klinische Bioshedding-Studien zu unterstützen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere Schritte des ddPCR-Protokolls, die für die ordnungsgemäße Durchführung des Assays entscheidend sind. Der erste kritische Schritt ist das Design und die Optimierung der Primer und der Sonde. Im Allgemeinen wird die Verwendung von Hydrolysesonden-basierter Chemie gegenüber farbstoffbasierter Chemie (z. B. SYBR Green) in einem präklinischen oder klinischen Umfeld aufgrund ihrer überlegenen Spezifität empfohlen. Darüber hinaus ist die Wahl des Amplifikationsziels von entscheidender Bedeutung. Typischerweise wird das Transgen des interessierenden Vektors anvisiert. In früheren präklinischen Stadien oder bei Vektoren, bei denen es möglicherweise nicht möglich ist, Vektortransgen von genomischer DNA zu unterscheiden, kann es jedoch sinnvoll sein, standardisierte Vektorziele zu verwenden. Zum Beispiel könnte man auf die invertierte terminale Wiederholungsregion, den Promotor, den Poly-A-Schwanz oder die Verbindungen zwischen den Segmenten zwischen diesen Vektorkomponenten abzielen. Die Wahl des Ziels hängt vom Vektordesign ab. Herkömmliche qPCR-Primer- und Sondendesignstrategien und -software sind in der Regel für die ddPCR geeignet. Konstruktionsparameter, von denen erwartet wird, dass sie eine konstante Glühtemperatur (z. B. 60 °C) ergeben, sollten ausgewählt werden, um den erforderlichen Optimierungsaufwand zu reduzieren. Es wurde auch empfohlen, mindestens drei verschiedene Sets für jedes Ziel zu entwerfen, zu bestellen und zu bewerten. Man sollte dann das Set auswählen, das die größte Spezifität (keine Amplifikation in der Negativkontrollvertiefung oder in einer Matrix verwandter Ziel-DNA) und Sensitivität (d. h. Nachweisgrenze) aufweist20.
Wenn es vorteilhaft ist, den Assay zwischen qPCR und ddPCR wechseln zu können, wird empfohlen, zuerst die Assay-Bedingungen mit qPCR zu optimieren und Bedingungen für das ausgewählte Set zu identifizieren, die zu Amplifikationseffizienzen von 90%-110% mit einemR2-≥ 0,98 führen. Die ddPCR als Endpunktmethode ist jedoch aufgrund von Varianzen in der Amplifikationseffizienz in der Regel weniger empfindlich als die qPCR. Es wird empfohlen, mindestens einen thermischen Temperaturgradienten im Glüh-/Verlängerungsschritt zu fahren, um Temperaturen über und unter den erwarteten Glühtemperaturen abzudecken und den Regen- und Fluoreszenzamplitudenabstand zwischen den negativen und positiven Tröpfchenclustern in Abhängigkeit von der Temperatur zu bewerten. Wenn der Arbeitsbereich es zulässt, empfiehlt es sich, individuelle dedizierte Arbeitsplätze für die Mastermix-Vorbereitung, das Hinzufügen von Vorlagen und die Verstärkung zu haben. Wenn möglich, sollten diese durch einen unidirektionalen Arbeitsablauf mit integrierten technischen Kontrollen, wie z. B. kontrolliertem Zugang und unterschiedlichen Luftdrücken, physisch getrennt werden, um das Risiko von Kreuzkontaminationen und Fehlalarmen zu verringern. Wenn dies nicht möglich ist, muss äußerste Vorsicht walten lassen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
Es gibt zwei Schritte in diesem Protokoll, die für diejenigen, die eher an die Entwicklung von qPCR-Assays gewöhnt sind, ungewöhnlich erscheinen mögen. Die erste ist die Aufnahme eines Restriktionsenzyms in den PCR-Mastermix. Während der ddPCR-Amplifikation wird jedes Tröpfchen bis zum Endpunkt thermozyklisiert. In einem richtig optimierten Assay führt dies zu zwei Populationen von Tröpfchen, von denen eine Gruppe ein konstant hohes Maß an Fluoreszenzsignalen aufweist – die positiven Signale – und ein anderes konsistent ein niedriges Fluoreszenzsignal aufweist – die negativen Signale. Wenn eine PCR-Interferenz auftritt, kann dies die Initiierung der PCR-Amplifikation desynchronisieren, was dazu führt, dass das Tröpfchen kein Amplifikationsplateau erreicht und somit inkonsistente Fluoreszenzendpunkte aufweist. In diesem Fall werden die Tröpfchen zwischen den Negativen und den Positiven verteilt, was zu einem Phänomen führt, das als ddPCR-Regen bezeichnet wird. Dies kann zu einer ungenauen Quantifizierung des Ziels und zu inkonsistenten und subjektiv angewandten Schwellenwerten führen. Unsere Empfehlung, den Schwellenwert leicht über dem Signal des NTC zu setzen, was die Auswirkungen von Regen in der endgültigen Quantifizierung minimieren sollte, da alle Tröpfchen immer noch als positiv angesehen werden, auch wenn sie nicht vollständig bis zum Endpunkt zyklisiert sind. AAVs haben eine hochkomplexe Sekundärstruktur, die je nach Amplifikationsziel die Zugänglichkeit zu den Primern und Sonden einschränken kann, was zu PCR-Interferenzen und damit zu Regen führen kann. Die Aufnahme des Restriktionsenzyms in die Mastermischung spaltet diese Sekundärstruktur, um den Zugang für die Primer und Sonden zu verbessern und den Regen zu reduzieren, was dadurch die Genauigkeit des Assays verbessern kann. Die Effekte des Einschlusses eines Restriktionsenzyms in die ddPCR-Reaktion wurden bereits beschrieben25,32. Jedes Restriktionsenzym kann verwendet werden, solange bestätigt wird, dass es nicht innerhalb des Zielamplifikationsbereichs schneidet. Es sind keine Voraufschlussschritte oder alternative Pufferzusammensetzungen erforderlich.
Der zweite ungewöhnliche Schritt ist die Aufbereitung der AAV-haltigen Tränenprobe. In diesem Protokoll wurde ein Tränenverhältnis von 1:10 (oder mehr) verwendet und anschließend die Probe erhitzt. Wenn Tränen über ein Kapillarröhrchen gesammelt werden, was eine weit verbreitete Entnahmemethode ist, können in der Regel durchschnittlich etwa 10,0 μl gesammelt werden33. Die Verdünnung trägt dazu bei, das begrenzte Probenvolumen zu beheben und genügend Material für die Untersuchung von Doppelbohrungen bereitzustellen. Dies verringert zwar die theoretische Nachweisgrenze, aber die robuste Sensitivität der ddPCR sollte immer noch dazu führen, dass alle bis auf eine extrem wenige Anzahl von Vektorpartikeln nachgewiesen werden können. Dieser Ansatz schafft zusätzlich einen “Backup”-Brunnen, falls einer unerwartet ausfallen sollte. In diesem Fall oder bei unzureichendem Probenvolumen für den Betrieb von zwei Bohrlöchern könnte der Poisson-Fehler zur Beurteilung der Präzision verwendet werden. Darüber hinaus bietet es in Fällen, in denen die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze liegt, die Möglichkeit, Bohrlochdaten zusammenzuführen, um eine Konzentration zu bestimmen. Für den ddPCR-Nachweis ist es notwendig, die AAV-Vektoren von den viralen Kapsiden zu befreien. Einige Methoden zur Quantifizierung von AAV beinhalten einen Proteinase-K-Verdauungsschritt, um das virale Kapsid34,35,36 zu entfernen. Alle natürlich vorkommenden AAV-Serotypen haben Schmelztemperaturen bei oder unter etwa 90 °C, wobei die meisten unter 80 °C fallen; Daher scheint dies eine unnötige Aufnahme zu sein37. Erhitzen allein scheint auszureichen, um Vektor-DNA freizusetzen.
Darüber hinaus ist die ddPCR im Allgemeinen weniger anfällig für PCR-Inhibitoren, die in einer Probe vorhanden sein können und einen qPCR-Assay beeinflussen können. Wenn ein bestimmter DNA-Isolationsschritt enthalten ist, würde dies ebenfalls eine spezifische Validierung erfordern, die in diesem Protokoll vermieden wird. Die Proben werden vor dem Erhitzen aufgrund der Kinetik der Diffusion der Vektorgenome in einer Flüssigkeit verdünnt. Während des Erhitzungs- und anschließenden Abkühlprozesses können die positiven und negativen Sense-Stränge des einzelsträngigen DNA-Genoms zusammenglühen, um ein doppelsträngiges Zwischenprodukt zu erzeugen, wenn die Konzentrationen ausreichend hoch sind. Die Verdünnung vor dem Erhitzen verringert die Konzentrationen und macht es mathematisch unwahrscheinlich, dass sich genügend doppelsträngige Zwischenprodukte bilden, um die Genauigkeit der Quantifizierung nachteilig zu beeinflussen. Es ist zu beachten, dass die synthetischen DNA-Fragmente oder linearisierten Plasmide, die als Qualitätskontrollen verwendet werden, diesem Erhitzungsschritt nicht unterzogen werden dürfen. Da diese doppelsträngig sind, würde eine Erwärmung zu einer Umwandlung in einzelsträngige Zwischenprodukte führen. Nach der unabhängigen Aufteilung dieser einzelsträngigen QCs in Tröpfchen wäre zu erwarten, dass dies zu einer Verdoppelung der QC-Konzentration im Vergleich zur Nennkonzentration führen würde. Wenn QCs erhitzt werden sollen, um die Methode zu standardisieren, muss dies alternativ bei der Rekonstitution und Zuweisung einer Nennkonzentration berücksichtigt werden.
In Bezug auf die Probenvorbereitung empfehlen viele Protokolle auch die Aufnahme eines DNase-Behandlungsschritts, um nicht verkapselte Vektor-DNA zu entfernen. Dieser Schritt ist kritisch in Fällen, in denen es nicht erwünscht ist, freie DNA zu quantifizieren, die mit der Vektorpräparation assoziiert ist (z. B. während der Quantifizierung zu Dosierungszwecken). Im Zusammenhang mit Biodistributions- und Bioshedding-Studien möchte man jedoch in der Regel wissen, wohin eine Vektor-DNA gereist ist, unabhängig davon, ob sie eingekapselt ist oder nicht. Daher wird empfohlen, während solcher Studien in der Regel keinen DNase-Behandlungsschritt durchzuführen. Wenn festgestellt wird, dass ein DNase-Schritt erforderlich ist, sollte dieser Schritt vor der Verdünnung und Erhitzung erfolgen.
In diesem Beitrag werden Daten vorgestellt, die repräsentativ für den Ansatz zur Bewertung des Dynamikbereichs, der Sensitivität, der Genauigkeit und der Präzision der Methode im Kontext einer zweckmäßigen, der guten Laborpraxis entsprechenden Validierung sind. Der derzeitige Mangel an Leitlinien zu diesem Thema überlässt es den validierenden Laboratorien, die Ziel-Assay-Kriterien für sich selbst festzulegen, im Einklang mit dem aktuellen Denken der Branche. Verschiedene Gruppen haben sowohl höhere als auch niedrigere Zielkriterien als in dieser Studie verwendet 19,20,21,22,23,24,25. Die Ziel-Assay-Kriterien sollten, bis sie strenger definiert sind, vor der Validierung auf der Grundlage der beabsichtigten klinischen Anwendungen der Methode ausgewählt werden. Abhängig von den nachgelagerten Entscheidungen, die auf der Grundlage der Daten zu treffen sind, kann ein höheres Maß an Genauigkeit und Präzision erforderlich sein. Umgekehrt kann ein einfaches positives versus negatives Ergebnis ausreichend sein.
Der Ansatz befasste sich auch mit Empfehlungen zur Bewertung der Spezifität und eines Matrixeffekts. Eine Lache von Tränen, die von unbehandelten Personen gesammelt wurden, führte in diesem Assay nicht zu einem positiven Ergebnis, während das Ziel nachgewiesen werden konnte, wenn der Vektor in einer hohen und niedrigen Konzentration innerhalb der empfohlenen Wiederfindungsraten in die Tränen gestochen wurde. Idealerweise wird auch eine Matrix, die einen endogenen Vektor enthält (z. B. nach einer Behandlung mit einem viralen Vektor) in diese Bewertungen einbezogen. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass solche Proben für die Verwendung in einer Validierung zur Verfügung stehen. Um die Robustheit der Validierung zu erhöhen, könnten mehrere Tränenpools oder Tränen, die von einer Vielzahl von Individuen gesammelt wurden, ausgewertet werden, um festzustellen, ob ein patientenspezifischer Matrixeffekt auftritt. Schließlich empfiehlt es sich, die Stabilität zu bewerten. Bei Arbeitsabläufen, bei denen die DNA-Extraktion aus der biologischen Matrix erfolgt, kann es erforderlich sein, die Stabilität sowohl der Probe als auch der extrahierten DNA zu bewerten. Bei diesem Workflow wird die Probe direkt im Assay getestet, ohne dass eine DNA-Extraktion erforderlich ist. Daher muss bei der Bewertung der Stabilität für diese Methode die Stabilität der Tränenproben bewertet werden. In der Regel werden Tisch-, Kühlschrank-, Gefrier-/Auftau- und Langzeitstabilitätsbewertungen empfohlen. Diese wurden nicht im Rahmen dieser Studie durchgeführt, aber die hier entwickelten Methoden können nach Manipulationen an den Eingangsproben in dieser Bewertung verwendet werden.
Insgesamt hat sich diese Methode als robuster, wiederholbarer und validierbarer Assay zum Nachweis von AAV-basierten Vektoren in Tränenproben erwiesen. Es kann als Plattform dienen, die an bestimmte Vektoren angepasst werden kann, um klinische Studien zu unterstützen, und bietet eine Grundlage für die Validierung eines Assays im Einklang mit der guten Laborpraxis.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Nick Russell und Brandon McKethan von Bio-Rad für die hilfreichen Gespräche während der Entwicklung dieser Methode.
Materials
| AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
| AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
| DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
| PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
| Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
| Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
| Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
| Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
| TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
| Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |
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