בדיקת תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי טיפתי לזיהוי וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו במחקרי שפיכה ביולוגית של דמעות
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ותיקוף של שיטות מעבדה טובות בזיהוי תואם של וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו בדמעות אנושיות על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית לתמיכה בפיתוח קליני של וקטורים של ריפוי גנטי.
Abstract
השימוש בווקטורים נגיפיים לטיפול במחלות גנטיות גדל משמעותית בשנים האחרונות, עם למעלה מ-2,000 מחקרים שנרשמו עד כה. וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAV) מצאו הצלחה מיוחדת בטיפול במחלות הקשורות לעיניים, כפי שהודגם באישור של voretigene neparvovec-rzyl. כדי להביא טיפולים חדשים לשוק, סוכנויות רגולטוריות בדרך כלל מבקשות מחקרי ביושפידינג מוסמכים או מתוקפים כדי להעריך את שחרור הווקטור לסביבה. עם זאת, לא פורסמו הנחיות רשמיות לפיתוח בדיקות מבוססות מולקולרית לתמיכה במחקרי נשירה כאלה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי, מה שמשאיר את המפתחים לקבוע שיטות עבודה מומלצות עבור עצמם. מטרת פרוטוקול זה היא להציג פרוטוקול תקף לזיהוי וקטורי AAV בדמעות אנושיות על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית (ddPCR) לתמיכה במחקרי ביושפיכה קליניים. כתב יד זה דן בגישות הנוכחיות בתעשייה לאימות בדיקות מולקולריות ומדגים כי השיטה חורגת מקריטריוני הקבלה של מבחני היעד המוצעים כיום בסקירות טכניות. לבסוף, צעדים קריטיים בביצועים של כל מבחן ddPCR, ללא קשר ליישום, נדונים.
Introduction
הגדרות הטיפול הגנטי משתנות, אך בדרך כלל גורמות להחלפה קבועה מכוונת ולעתים קרובות צפויה של רצף דנ”א ספציפי של הגנום התאי כדי לשנות או לשנות את הביטוי של גן או לשנות את התכונות הביולוגיות של תא חי למטרה קלינית 1,2. וקטורים נגיפיים משמשים יותר ויותר ככלי לריפוי גנטי בשל יעילות ההתמרה שלהם, כאשר דו”ח אחד מציע כי מעל 70% מהניסויים הקליניים הנוכחיים בריפוי גנטי משתמשים בווקטורים נגיפיים3. העניין בווקטורים נגיפיים לריפוי גנטי הולך וצובר תאוצה. דו”ח הנתונים הרבעוני לרבעון 4 לשנת 2022 על נוף הטיפול בגנים, תאים ורנ”א של האגודה האמריקאית לתרפיה גנטית ותאית דיווח כי בשנת 2022, צנרת הטיפול בגנים, תאים ורנ”א מפרה-קליני לרישום מוקדם גדלה ב-7%, מה שמביא את המספר הכולל של טיפולים בפיתוח ל-3,726, מתוכם 2,053 (55%) טיפולים גנטיים4. מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) אישר כיום 27 טיפולים תאיים וגנטיים לשימוש קליני בבני אדם, חמישה מהם משתמשים באופן ספציפי בווקטורים נגיפיים5.
וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) זכו להתעניינות ספציפית ככלי לריפוי גנטי. מטא-אנליזה שנערכה לאחרונה חשפה כי בשני העשורים האחרונים נערכו כ-136 ניסויים קליניים שחקרו את השימוש ב-AAVs6. בנוסף, שלושה מתוך חמשת הטיפולים הגנטיים שאושרו על ידי ה- FDA בארה”ב מבוססים על AAV. זאת בשל אופיים הניתן לעריכה ברמה גבוהה, טווח מארחים רחב שניתן לכוונן על בסיס שימוש בווקטורים ספציפיים המתרחשים באופן טבעי או מהונדסים באופן מלאכותי, פתוגניות נמוכה ורעילות בבני אדם, ואימונוגניות נמוכה בדרך כלל 7,8. AAVs שימשו בהצלחה גם לטיפול במחלות עיניים במסגרת קלינית מאושרת. Voretigene neparvovec-rzyl הוא טיפול מבוסס AAV2 שאושר על ידי ה- FDA האמריקאי בשנת 2017 ועל ידי סוכנות התרופות האירופית (EMA) בשנת 2018 לטיפול בניוון רשתית9 הקשור למוטציה ביאלית RPE65.
עם העניין הגובר בפיתוח טיפולים מבוססי AAV מגיע הצורך בהדרכה רגולטורית על בדיקות. זיהוי וכימות מדויקים של כל וקטור נגיפי הוא חלק בלתי נפרד משלבי הגילוי, הייצור והבדיקות הפרה-קליניות/קליניות של פיתוח המוצר. ה- FDA בארה”ב החל לפרסם כמה הנחיות לטיפולים גנטיים, כולל על הכימיה, הייצור והבקרה של ריפוי גנטי אנושי יישומי תרופות חדשות ניסיוניות 10, מעקב ארוך טווח לאחר מתן טיפול גנטי11, בדיקות רטרו-וירוס כשירות שכפול 12, והמלצות לווקטורים מיקרוביאליים המשמשים בטיפולים גנטיים 13. ה- EMA פרסם גם שורה של הנחיות הנוגעות לפיתוח מוצרי ריפוי גנטי שבדרך כלל מתיישרים עם המלצות ה- FDA, אם כי קיימים כמה הבדלים14. חשוב לציין כי בעוד שהנחיות אלה אינן קובעות אחריות הניתנת לאכיפה משפטית, למעט כאשר יש התייחסות לתקנות ספציפיות, הן מספקות בהירות לגבי החשיבה הנוכחית של רשויות רגולטוריות בנושא וציפיותיהן לבדיקות הנדרשות להגשת תרופות ואישור רגולטורי.
ה- FDA ממליץ באופן ספציפי כי יש לערוך מחקרים כדי להעריך את ההתפלגות, ההתמדה והפינוי של וקטור מאתר מתן כדי להתמקד ברקמות עיניים ולא עיניות, נוזלים תוך עיניים ודם15. אלה לובשים צורה של הפצה ביולוגית ומחקרי שפיכה. מחקרי הפצה ביולוגית מעריכים חשיפה על ידי חקירת האופן שבו מוצר מתפשט בכל גופו של המטופל מאתר הנטילה. שפיכה מעריכה באופן ספציפי את שחרור המוצר מהמטופל לסביבה ומעלה את האפשרות להעברת הווקטור לאנשים לא מטופלים16. ה-FDA ממליץ על תכנון מחקרי הפצה ביולוגית ושפיכה ביחס לתדירות איסוף הדגימות, משך איסוף הדגימות, סוגי הדגימות שנאספו ותנאי האחסון.
בנוסף, ה- FDA ממליץ על שימוש בתגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR, או PCR בזמן אמת) לזיהוי כמותי של גנומים וקטוריים בשל קלות הביצועים שלה, פורמט תפוקה גבוהה, זמני אספקה מהירים ורגישות לבדיקה. עם זאת, קיים מחסור יחסי בהמלצות לתכנון והערכת ביצועים של שיטות מולקולריות בהשוואה לאלה הקיימות עבור מולקולות קטנות וגדולות. רבות מההנחיות למחקרים כאלה קשות ליישום על שיטות מולקולריות בשל העיצוב הייחודי והמורכב הן של המוצרים והן של הבדיקות עצמן, מה שמעלה שאלות לגבי נאותות הפלטפורמות הזמינות להערכות המומלצות והשיטות המתאימות לאימות הבדיקה. עד כה, ה- FDA לא דרש אימות רשמי של בדיקות מבוססות PCR, אם כי EMA הטיל דרישה זו17. לאור חלל זה, קבוצות וסדנאות שונות פרסמו סקירות טכניות והמלצות שיצרנים וארגוני מחקר קבלניים ביקשו לעקוב אחריהם18,19,20,21,22,23,24,25. רוב ההמלצות הללו נכתבות במיוחד תוך התחשבות במבחני qPCR, עם הצעות או שינויים לפלטפורמות מתפתחות, כגון PCR דיגיטלי טיפתי (ddPCR), הכלולות רק כרלוונטיות. המלצות עדכניות יותר התמקדו בשיקולים של בדיקות ddPCR, אך התמקדו בעיקר ביישומן לכימות גנום וקטורי בסביבת ייצור ולא במטריצות ביולוגיות מורכבות בהן נתקלים במחקרי ביושפידינג.
בהתאם ליישום קליני ומטרות, ddPCR עשוי להיות מועדף על פני qPCR לתמיכה במחקרי הפצה ביולוגית ונשירה בשל הרגישות המוגברת של ddPCR ויכולתו להתמודד עם הפרעות מטריצה בהשוואה ל- qPCR. יתר על כן, בשל חלוקת הדגימות לכ-20,000 טיפות, ניתן להשיג כימות מדויק של מספר ההעתקה ללא שימוש בעקומה סטנדרטית באמצעות סטטיסטיקת פואסון, דבר המפשט את פיתוח השיטה ותיקוףה. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר גישה סטנדרטית לפיתוח ותיקוף של שיטה מבוססת ddPCR לזיהוי וקטורי AAV בדמעות שנאספו מפני השטח של העין לתמיכה במחקרים קליניים של נשירה ביולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר שלבים של פרוטוקול ddPCR שהם קריטיים לביצועים נאותים של הבדיקה. השלב הקריטי הראשון הוא תכנון ואופטימיזציה של פריימרים ובדיקה. באופן כללי, מומלץ להשתמש בכימיה מבוססת בדיקת הידרוליזה על פני כימיה מבוססת צבע (למשל, SYBR Green) בסביבה פרה-קלינית או קלינית בשל הספציפיות הגבוהה שלהם. בנוסף, בחירת יעד ההגברה היא קריטית. בדרך כלל, טרנסגן העניין של הווקטור ממוקד. עם זאת, בשלבים פרה-קליניים מוקדמים יותר או בווקטורים שבהם ייתכן שלא ניתן להבחין בין טרנסגן וקטורי לעומת דנ”א גנומי, ייתכן שיהיה נכון להשתמש במטרות וקטוריות סטנדרטיות. לדוגמה, ניתן לכוון לאזור החוזר הטרמינלי ההפוך, למקדם, לזנב פולי-A, או לצמתים הבין-מקטעים בין רכיבים וקטוריים אלה. בחירת המטרה תשתנה בהתאם לתכנון הווקטורי. פריימר qPCR מסורתי ואסטרטגיות תכנון בדיקה ותוכנה מתאימים בדרך כלל ל- ddPCR. יש לבחור פרמטרים של תכנון שצפויים להניב טמפרטורת חישול עקבית (לדוגמה, 60°C) כדי להפחית את כמות המיטוב הנדרשת. כמו כן, הומלץ לתכנן, להזמין ולהעריך לפחות שלוש קבוצות שונות עבור כל מטרה. לאחר מכן יש לבחור את הקבוצה שמראה את הספציפיות הגדולה ביותר (ללא הגברה בבאר הבקרה השלילית או במטריצה של דנ”א מטרה קשור) ואת הרגישות (כלומר, גבול הזיהוי)20.
אם יש יתרון ביכולת להעביר את הבדיקה בין qPCR ל- ddPCR, מומלץ לייעל תחילה את תנאי הבדיקה באמצעות qPCR, ולזהות תנאים לקבוצה שנבחרה המביאים ליעילות הגברה של 90%-110% עם R2 ≥ 0.98. עם זאת, ddPCR כשיטת נקודת קצה היא בדרך כלל פחות רגישה מאשר qPCR בשל שונות ביעילות הגברה. לכל הפחות, מומלץ להפעיל שיפוע טמפרטורה תרמי בשלב החישול/הרחבה כדי לכסות טמפרטורות מעל ומתחת לטמפרטורות החישול הצפויות ולהעריך את הפרדת משרעת הגשם והפלורסנט בין צבירי הטיפות השליליות והחיוביות כפונקציה של טמפרטורה. אם סביבת העבודה מאפשרת, מומלץ שיהיו תחנות עבודה ייעודיות נפרדות להכנת מיקס אב, הוספת תבנית והגברה. במידת האפשר, יש להפריד אותם פיזית על ידי זרימת עבודה חד-כיוונית עם בקרות הנדסיות מובנות, כגון גישה מבוקרת ולחצי אוויר דיפרנציאליים, כדי להפחית את הסיכון לזיהום צולב ולתוצאות חיוביות שגויות. אם הדבר אינו אפשרי, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע זיהום צולב.
ישנם שני שלבים בפרוטוקול זה שעשויים להיראות יוצאי דופן למי שרגיל יותר לפיתוח בדיקת qPCR. הראשון הוא הכללת אנזים הגבלה בתמהיל המאסטר PCR. במהלך הגברה ddPCR, כל טיפה עוברת מחזור תרמי לנקודת הקצה. בבדיקה ממוטבת כראוי, התוצאה היא שתי אוכלוסיות של טיפות, קבוצה אחת מציגה רמה גבוהה באופן עקבי של אותות פלואורסצנטיים – החיוביים – וקבוצה אחרת מציגה באופן עקבי רמה נמוכה של אות פלואורסצנטי – השליליים. אם מתרחשת הפרעה ל-PCR, היא עלולה לבטל את הסנכרון של התחלת הגברה של PCR, וכתוצאה מכך הטיפה לא תגיע לרמת הגברה, ולכן נקודות קצה פלואורסצנטיות לא עקביות. במקרה זה, הטיפות יפוזרו בין השליליות לחיוביות, וכתוצאה מכך נוצרת תופעה הנקראת גשם ddPCR. זה יכול לגרום לכימות לא מדויק של היעד וליישום לא עקבי וסובייקטיבי של ערכי סף. המלצתנו לקבוע את הסף מעט מעל האות של NTC, מה שאמור למזער את השפעות הגשם בכימות הסופי מכיוון שכל הטיפות עדיין נחשבות חיוביות, גם אם לא מחזוריות לחלוטין לנקודת הקצה. ל-AAV יש מבנה משני מורכב ביותר, אשר בהתאם ליעד ההגברה, עלול להפחית את הנגישות לפריימרים ולבדיקות, וכתוצאה מכך הפרעות PCR ולכן גשם. הכללת אנזים ההגבלה בתערובת האב חותכת את המבנה המשני הזה כדי להגדיל את הגישה של הפריימרים והגשושיות, ומפחיתה את הגשם, מה שעשוי לשפר בכך את דיוק הבדיקה. ההשפעות של הכללת אנזים הגבלה בתגובת ddPCR תוארו בעבר25,32. ניתן להשתמש בכל אנזים הגבלה, כל עוד הוא מאושר שאינו חותך באזור הגברת המטרה. אין צורך בשלבי עיכול מקדים או בהרכבי חיץ חלופיים.
השלב החריג השני הוא הכנת דגימת הדמעות המכילה AAV. בפרוטוקול זה נעשה שימוש ביחס של 1:10 (או יותר) של דמעות ולאחר מכן הדגימה חומה. בדרך כלל, כאשר דמעות נאספות באמצעות צינור נימי, שהוא שיטת איסוף נפוצה, בממוצע כ 10.0 μL ניתן לאסוף33. הדילול מסייע לטפל בנפח הדגימה המוגבל ולספק מספיק חומר לבדיקת בארות כפולות. בעוד שזה מפחית את הגבול התיאורטי של זיהוי, הרגישות החזקה של ddPCR עדיין צריכה לגרום לזיהוי של כל למעט מספר קטן מאוד של חלקיקים וקטוריים. גישה זו גם יוצרת “גיבוי” היטב אם אחד מהם היה נכשל באופן בלתי צפוי. במקרה זה, או במקרים של נפח דגימה לא מספיק כדי להפעיל שתי בארות, שגיאת פואסון יכולה לשמש להערכת דיוק. יתר על כן, במקרים בהם הריכוז הוא מתחת לגבול הגילוי, זה יוצר הזדמנות למזג נתוני באר כדי לקבוע ריכוז. יש צורך לשחרר את וקטורי AAV מן capsids ויראלי עבור זיהוי ddPCR. כמה שיטות לכימות של AAV כללו שלב עיכול פרוטאינאז K כדי להסיר את הקפסיד הנגיפי34,35,36. לכל הסרוטיפים הטבעיים של AAV יש טמפרטורות התכה של כ -90 מעלות צלזיוס או פחות, כאשר רובם נופלים מתחת ל -80 מעלות צלזיוס; לכן, נראה שמדובר בהכללה מיותרת37. נראה כי חימום לבדו מספיק כדי לשחרר דנ”א וקטורי.
יתר על כן, ddPCR הוא בדרך כלל פחות רגיש מעכבי PCR שעשויים להיות נוכחים במדגם שעשוי להשפיע על בדיקת qPCR. אם שלב בידוד DNA ספציפי נכלל, זה ידרוש גם אימות ספציפי, אשר נמנע בפרוטוקול זה. הדגימות מדוללות לפני החימום עקב קינטיקה של דיפוזיה של הגנום הווקטורי בנוזל. במהלך תהליך החימום והקירור שלאחר מכן, גדילי החישה החיוביים והשליליים של גנום הדנ”א החד-גדילי יכולים להתלכד יחד וליצור מתווך דו-גדילי אם הריכוזים גבוהים מספיק. דילול לפני חימום מפחית את הריכוזים והופך את זה לבלתי סביר מבחינה מתמטית שמספיק מתווכים דו-גדיליים נוצרים כדי להשפיע לרעה על דיוק הכימות. יש לציין כי אסור שמקטעי DNA סינתטיים או פלסמידים ליניאריים המשמשים כבקרות איכות יעברו שלב חימום זה. מכיוון שמדובר בדו-גדילי, חימום יגרום להמרה למתווכים חד-גדיליים. לאחר חלוקה עצמאית של QC חד-גדילי אלה לטיפות, הדבר צפוי לגרום לעלייה כפולה בריכוז ה-QC ביחס לריכוז הנומינלי. לחלופין, אם רוצים לחמם QCs כדי לתקנן את השיטה, יש לקחת זאת בחשבון בבנייה מחדש ובהקצאה של ריכוז נומינלי.
לבסוף, בנוגע להכנת דגימות, פרוטוקולים רבים ממליצים גם על הכללת שלב טיפול DNase כדי להסיר כל DNA וקטורי לא קפסול. שלב זה הוא קריטי במקרים בהם לא רצוי לכמת DNA חופשי הקשור להכנת הווקטור (כגון במהלך כימות למטרות מינון). עם זאת, בהקשר של התפלגות ביולוגית ומחקרי ביו-שפיכה, בדרך כלל רוצים לדעת לאן עבר דנ”א וקטורי כלשהו, ללא קשר אם הוא עטוף או לא. לכן, מומלץ בדרך כלל לא לבצע שלב טיפול DNase במהלך מחקרים כאלה. אם נקבע כי יש צורך לכלול שלב DNase, שלב זה צריך להיות לפני דילול וחימום.
במאמר זה מוצגים נתונים המייצגים את הגישה להערכת הטווח הדינמי, הרגישות, הדיוק והדיוק של השיטה בהקשר של אימות מתאים למטרה ותואם לשיטות מעבדה טובות. היעדר ההנחיות הנוכחיות בנושא זה מותיר את מעבדות התיקוף לקבוע לעצמן קריטריונים לבדיקת יעדים, בהתאם לחשיבה הנוכחית בתעשייה. קבוצות שונות הציבו קריטריוני יעד גבוהים ונמוכים יותר מאלה ששימשו במחקר זה: 19,20,21,22,23,24,25. יש לבחור את קריטריוני בדיקת היעד, עד להגדרתם הנוקשה יותר, לפני התיקוף בהתבסס על היישומים הקליניים המיועדים של השיטה. בהתאם להחלטות במורד הזרם שיש לקבל על בסיס הנתונים, ייתכן שיהיה צורך ברמות גבוהות יותר של דיוק ודיוק. לעומת זאת, תוצאה חיובית לעומת שלילית פשוטה עשויה להספיק.
הגישה התייחסה גם להמלצות להערכת ספציפיות ואפקט מטריצה. שלולית של דמעות שנאספו מאנשים שלא טופלו לא הניבה תוצאה חיובית בבדיקה זו, בעוד שניתן היה לזהות את המטרה כאשר הווקטור נדקר לתוך הדמעות בריכוז גבוה ונמוך במסגרת שיעורי ההחלמה המומלצים. באופן אידיאלי, מטריצה המכילה וקטור אנדוגני (למשל, שנאספה בעקבות טיפול בווקטור נגיפי) תיכלל גם היא בהערכות אלה. עם זאת, אין זה סביר כי דגימות כאלה יהיו זמינות לשימוש בתיקוף. כדי להגביר את החוסן של התיקוף, ניתן להעריך בריכות מרובות של דמעות, או דמעות שנאספו ממגוון אנשים, כדי לקבוע אם מתרחש אפקט מטריצה ספציפי למטופל. לבסוף, מומלץ להעריך את היציבות. בתהליכי עבודה שבהם מיצוי דנ”א מתרחש מתוך המטריצה הביולוגית, ייתכן שיהיה צורך להעריך את יציבות הדגימה והדנ”א שחולץ. בתהליך עבודה זה, הדגימה נבדקת ישירות בבדיקה ללא צורך במיצוי DNA. לכן, בהתחשב בהערכת היציבות של שיטה זו, יש להעריך את יציבות דגימות הדמעות. בדרך כלל, מומלץ לבצע הערכות ספסל, מקרר, הקפאה/הפשרה ויציבות לטווח ארוך. אלה לא בוצעו במסגרת מחקר זה, אך ניתן להשתמש בשיטות שפותחו כאן בהערכה זו, לאחר מניפולציות לדגימות הקלט.
בסך הכל, שיטה זו הוכחה כבדיקה חזקה, חוזרת וניתנת לאימות לזיהוי וקטורים מבוססי AAV בדגימות דמעות. הוא עשוי לשמש כפלטפורמה להתאמה לווקטורים ספציפיים לתמיכה בניסויים קליניים ומספק בסיס לאימות של בדיקה העולה בקנה אחד עם שיטות מעבדה טובות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לניק ראסל וברנדון מקייטן מ-Bio-Rad על הדיונים המועילים שלהם במהלך פיתוח שיטה זו.
Materials
| AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
| AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
| DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
| PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
| Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
| Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
| Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
| Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
| TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
| Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |
References
- Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. Is it ‘gene therapy. Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).
- Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update. The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).
- Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
- Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy Available from: https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx (2022)
- Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products (2022)
- Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).
- Lundstrom, K. Viral vectors in gene therapy. Diseases. 6 (2), 42 (2018).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31, 317-334 (2017).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug (2020)
- Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products (2020)
- Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during (2020)
- Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy (2016)
- Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency Available from: https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy (2023)
- Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders (2020)
- Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products (2015)
- Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf (2018)
- Kaur, S. white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A – recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B – regulatory agencies’ inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine). Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).
- Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories. The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).
- Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).
- Wissel, M. Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC. Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).
- Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme Available from: https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf (2018)
- Pinheiro, L., Emslie, K. R. Basic concepts and validation of digital PCR measurements. Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).
- Tzonev, S. Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean. Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).
- Prantner, A., Marr, D. Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR. PLoS One. 18, 0280242 (2023).
- Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/ (2023)
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer 3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Ye, J. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf (2023)
- Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Basu, A. Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR. SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).
- Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
- Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11, 10064 (2021).
- Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR. Genes. 12 (4), 601 (2021).
- Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate. Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Bennett, A., et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).
