التكاثر والمواءمة في البحث باستخدام المعايير البيولوجية: مثال على الببتيد المرتبط بالكولاجين ناهض الصفائح الدموية
Summary
نقدم هنا طريقة لتوحيد الببتيد المرتبط بالكولاجين المرتبط بالصفائح الدموية (CRP-XL) باستخدام قياس تراكم انتقال الضوء. بينما يستهدف البروتوكول وظيفة الصفائح الدموية ، يمكن تطبيق العملية التجريبية على معظم الجزيئات البيولوجية والمقايسات الحيوية لضمان الدقة العلمية وقابلية التكاثر.
Abstract
علم القياس – علم القياس – هو موضوع لا يتم تدريسه إلا لعدد قليل من علماء الأحياء في تدريبهم على حسابهم. يوفر تطبيق عمليات التقييس البسيطة على ممارسات العمل اليومية الثقة في البيانات وقابلية التكرار عبر المسافة والوقت.
توضح هذه الطريقة كيفية توحيد تجربة معملية أساسية تستخدم على نطاق واسع في أبحاث الإرقاء والممارسة السريرية ، وتحديدا قياس الاستجابات لمستقبلات الكولاجين في الصفائح الدموية (البروتين السكري [GP] VI) الببتيد المرتبط بالكولاجين ، المتصالب (CRP-XL) عن طريق قياس تجميع انتقال الضوء (LTA). سيضمن استخدام هذا النهج قابلية التكاثر داخل المختبر والتنسيق بين المختبرات ، بغض النظر عن مخزون أو مورد الناهض. الأهم من ذلك ، أن هذه الطريقة قابلة للتطبيق على ناهضات الصفائح الدموية الأخرى ، وفي الواقع ، العديد من الجزيئات البيولوجية والمقايسات الحيوية الأخرى.
تتضمن العملية الموضحة أدناه إجراء سلسلة تخفيف من 6 إلى 8 نقاط من “المعيار” و “الاختبار” (المادة التي تقوم بفحصها) وتشغيلها جنبا إلى جنب في اختبار مختار (في هذه الحالة ، LTA). يستخدم CRP-XL بتركيزات الكتلة / الحجم ، ولكن ليس كل مادة تعطي نفس النشاط البيولوجي عند تركيز معين ، لذلك يتم إجراء سلسلة تخفيف لمقارنة المعيار واختبار المواد وتحديد التركيز المطلوب لإعطاء نشاط مكافئ. يجب أن تمتد سلسلة التخفيف إلى تجميع 0-100٪. يتم رسم البيانات باستخدام الانحدار غير الخطي ، ويتم تحديد قيمة EC50 لكل عينة (قياسي واختبار). لتعيين النشاط ، قسم قيمة EC50 للمعيار على قيمة الاختبار لتحديد مدى قوته أو أقل قوة وضبط التركيز وفقا لذلك. سيضمن هذا النهج إضافة نفس “النشاط” البيولوجي إلى الفحص مرارا وتكرارا.
Introduction
يستخدم الكثير منا الناهضات والخصوم البيولوجية في تجاربنا ، وغالبا في الفحص البيولوجي الذي يحدد تأثيرها على وظيفة الخلية في ظل ظروف محددة. الطريقة الموصوفة هنا هي للببتيد المرتبط بالكولاجين ناهض الصفائح الدموية ، المتصالب (CRP-XL) ، وهو ناهض بروتين سكري VI ينشط الصفائح الدموية ويمكن قياس نشاطه في مجموعة متنوعة من المقايسات (قياس تجميع انتقال الضوء ، الفحص المجهري ، قياس التدفق الخلوي ، إطلاق Ca2+ ، إلخ) ، ولكن بروتوكول توحيد الناهض ينطبق على أي ناهض / مضاد بيولوجي و / أو مقايسة حيوية. العلوم الفيزيائية على دراية جيدة باستخدام المعايير في ممارسات العمل اليومية ، والشركات التي تطور أدوية العلاج الحيوي في القطاع التجاري تدرك قيمة استخدام المعايير المرجعية1 ، ومع ذلك لا تزال غير مستغلة بشكل كاف من قبل العديد من علماء الأحياء ، وخاصة في مجتمع البحث الأكاديمي ، ويؤثر عدم استخدامها سلبا على جودة الإنتاج العلمي.
CRP-XL هو ناهض محدد خاص ب GPVI استخدمه حقل الصفائح الدموية لعقود منذ وصفه في عام 19952 ، مما يساعد المجتمع على تحديد دور GPVI من دور بروتينات الصفائح الدموية الأخرى المرتبطة بالكولاجين منذ 3,4. يمكن شراء هذا الناهض من مجموعة متنوعة من المصادر التجارية أو إنتاجه داخليا. يمكن شراء مونومر الببتيد من مورد ثم ربطه داخليا أو يمكن للمورد القيام بذلك مقابل رسوم إضافية. يمكن تحقيق مزيد من التوفير في التكاليف عن طريق تقليل النقاء المطلوب عند التسليم (70٪ مقابل 95٪ ، على سبيل المثال). لا يوجد أيضا توافق في الآراء حول كيفية تخزين CRP-XL ، حيث يختار البعض التخزين بالتبريد والبعض الآخر التبريد ، والبعض الآخر يحتفظ بالمواد المجففة بالتجميد حتى الاستخدام ، والبعض الآخر يخزنها في محلول (ماء أو مخزن مؤقت ، حسب التفضيل). ولذلك، فإن نوعية وتكوين المخزونات المختبرية غير موحدة أو منسقة. نظرا لأن هذا الناهض يستخدم بتركيز محدد (كتلة / حجم) بدلا من وحدات النشاط ، فإن قوة CRP-XL في مختبر واحد ، على سبيل المثال ، عند 1 ميكروغرام / مل ، لن تكون هي نفسها الأخرى. تجدر الإشارة إلى أن ناهضات الصفائح الدموية الأخرى المستخدمة في هذا المجال موحدة بالفعل (على سبيل المثال ، الثرومبين ، الذي يتم توفيره واستخدامه في وحدات النشاط بدلا من الكتلة / الحجم) ، لذلك لا ينبغي أن يكون الانتقال من الكتلة / الحجم إلى الوحدات البيولوجية تحديا كبيرا للمجتمع. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن استجابات المرضى لمنبهات الصفائح الدموية ، بما في ذلك CRP-XL ، متغيرة من حيث حساسيتها للناهضات وكذلك قدرتها على الاستجابة (مدى الاستجابة)5 ، لذلك من المهم استخدام كميات ثابتة من نشاط الناهض في المقايسات.
إذا كان من الممكن تنسيق ناهضات الصفائح الدموية باستخدامها في نشاط محدد بدلا من الوزن / الحجم ، فيمكن التأكد من أن التجربة في أحد المختبرات قابلة للمقارنة مباشرة مع تلك الموجودة في المختبرات الأخرى ويمكن استنساخها بدقة وثقة. وإلى أن يحين الوقت الذي يتوصل فيه الحقل إلى اتفاق بشأن كيفية تخزين نشاط CRP-XL وتوحيده، من الضروري إجراء فحوصات منتظمة على المادة لضمان اتساقها على مدى الأشهر / السنوات التي تستخدم فيها.
يجب أن يتم تعيين قيمة النشاط للمعايير البيولوجية من خلال دراسات تعاونية متعددة المراكز (على سبيل المثال 6,7) وتتطلب خبرة متخصصة. وقد أبرزت مؤخرا الحاجة إلى معايير بيولوجية راسخة لمنبهات الصفائح الدموية من خلال دراسة تعاونية متعددة المراكز8 تدعمها الجمعية الدولية للتخثر والإرقاء (ISTH)؛ وإلى أن يتوفر معيار CRP-XL دولي، يمكن للباحثين توحيد المواد الخاصة بهم محليا لضمان الاتساق بمرور الوقت، وأن المواد الجديدة التي يتم الحصول عليها تجاريا أو داخليا ذات نشاط مماثل للاستعدادات السابقة، وكذلك تلك الخاصة ببقية المجتمع.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما هو موضح هنا ، فإن عملية توحيد المواد واضحة للغاية. على الرغم من أن الأمر يتطلب القليل من الوقت لتقييم دفعات جديدة من المواد و / أو للتحقق من أن الدفعة الحالية مستقرة ولا تفقد النشاط بمرور الوقت ، فإن المكافأة هي أن التجارب قابلة للتكرار مرارا وتكرارا ويمكن مقارنتها على مدار سنوات بدلا من مجرد عمر مجموعة من الكاشف. وهذا يعني أيضا أنه يمكن للباحثين الآخرين إعادة إنشاء ظروف الفحص بدقة وأن المجتمع متناسق على المستوى العالمي. تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول جمع الدم الكامل وإعداد PRP9 ، بالإضافة إلى الدقة عند إجراء سلسلة التخفيف. من المهم أيضا التأكد من أن منحنيات الاختبار والمعايير متوازية قبل متابعة مقارنة EC50 . إذا لم تكن الخطوط متوازية ، أو لم تكن خطوط التقارب متكافئة ، فقد يشير ذلك إلى أن الاختبار والمواد القياسية مختلفان إلى حد ما.
يعرف كل من يعمل في العلوم البيولوجية أن المقايسات البيولوجية لا تعمل دائما بشكل متسق ، لذلك يحتاج المرء إلى أن يضع في اعتباره ذلك عند تقييم البيانات. في المثال الموضح هنا، على الرغم من أننا نستخدم نفس المتبرعين لقياس فعالية مادتين متشابهتين للغاية، إن لم تكن متطابقتين، فإن منحدرات التلال وخطوط التقارب ليست متطابقة. ومع ذلك ، فإننا نقبل درجة من التباين ونستنتج أن المنحنيات ، في هذه الحالة ، متوازية ، وبالتالي فهي مناسبة لمقارنة وضبط الفاعلية. الجزيئات البيولوجية كبيرة ومعقدة ، ويمكن أن تؤثر التعديلات اللاحقة للترجمة أثناء التصنيع على فعاليتها في المقايسات الحيوية. لا يمكن توحيد الجزيئات الحيوية والمقايسات الحيوية باستخدام الكتلة أو الحجم فقط ويجب أن يتم ذلك عن طريق تحديد النشاط البيولوجي ومقارنته في المقايسة الحيوية11. يجب على المرء استخدام تدريبه وخبرته لتقييم البيانات في سياق الفحص.
تتمثل قيود التقنية في أنه على الرغم من أن البيانات قد تشير إلى وجود مشكلة في الكاشف (الكواشف) ، إلا أنها لا تستطيع إخبارك بالمشكلة. ستكون هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتحديد سبب عدم قابلية المواد للمقارنة. في عالم مثالي ، سيتم التحقق من أي مادة حاسمة للتجربة (التجارب) والاستنتاجات العلمية اللاحقة عن طريق التحليل الطيفي الكتلي ، ولكن هذا ليس دائما خيارا. ومع ذلك ، إذا كانت البيانات غير قابلة للمقارنة ، فلا يزال هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحقيقات في بعض الصفات. ومن القيود الأخرى لهذا النهج الوقت والموارد اللازمة للقيام بذلك. من الناحية المثالية ، يجب مقارنة الاختبار والمعيار في 3-6 مانحين لتوفير بعض الثقة في تعيين النشاط البيولوجي للمادة ، لكننا نشعر أن هذا له ما يبرره من خلال دعم التكاثر والموثوقية. ليست هناك حاجة إلى توحيد المواد البيولوجية في كل مرة يتم فيها إجراء التجارب ، ولكن على الأقل ، يجب أن يتم ذلك لكل دفعة جديدة من المنبهات ، ويفضل أن يكون ذلك بشكل متكرر ، اعتمادا على الاستقرار والاستخدام. في الواقع ، إذا تم توفير معيار ، فهذا شيء يمكن لمنظمات التقييس الدولية أن توفر وضوحا بشأنه.
في حين أن المثال الموضح هنا هو CRP-XL في سياق قياس تراكم الصفائح الدموية ، فإن بروتوكول مقارنة النشاط البيولوجي للجزيئات الحيوية في المقايسات الحيوية قابل للتطبيق على نطاق واسع عبر القطاع.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
| 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
| Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Prism | Graphpad | Analysis software package | |
| Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |
References
- Faya, P., et al. Potency assignment of biotherapeutic reference standards. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577 (2020).
- Morton, L. F., et al. Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity. The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).
- Pugh, N., et al. Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood. Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).
- Farndale, R. W., et al. Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).
- Dunster, J. L., et al. Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts. Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).
- Hubbard, A. R., et al. Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).
- Sergaki, C., et al. Developing whole cell standards for the microbiome field. Microbiome. 10 (1), 123 (2022).
- Alessi, M. C., et al. Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).
- Taylor, L., et al. Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing. PLoS One. 9 (6), e101209 (2014).
- Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. Applying the science of measurement to biology: Why bother. PLoS Biology. 17 (6), e3000338 (2019).
