שכפול והרמוניזציה במחקר באמצעות סטנדרטים ביולוגיים: הדוגמה של אגוניסט טסיות פפטיד הקשור לקולגן
Summary
כאן אנו מציגים שיטה לסטנדרטיזציה של אגוניסט טסיות הדם פפטיד הקשור לקולגן צולב (CRP-XL) באמצעות אגרגומטריה של העברת אור. בעוד שהפרוטוקול מכוון לתפקוד טסיות הדם, ניתן ליישם את התהליך הניסיוני על רוב המולקולות הביולוגיות והבדיקות הביולוגיות כדי להבטיח קפדנות מדעית ויכולת שחזור.
Abstract
מטרולוגיה – מדע המידה – היא נושא שרק מדענים ביולוגיים מעטים לומדים עליו בהכשרתם לרעתם; היישום של תהליכי סטנדרטיזציה פשוטים בנוהלי עבודה יומיומיים מספק ביטחון בנתונים ויכולת שחזור על פני מרחק וזמן.
שיטה זו מדגימה כיצד לתקנן ניסוי מעבדה מרכזי הנמצא בשימוש נרחב במחקר ובפרקטיקה הקלינית של המוסטזיס, בפרט, מדידת תגובות לקולטן קולגן טסיות הדם (גליקופרוטאין [GP]VI) אגוניסט פפטיד הקשור לקולגן, צולב (CRP-XL) על ידי אגרגומטריה של העברת אור (LTA). שימוש בגישה זו יבטיח שחזור תוך מעבדה והרמוניה בין מעבדות, ללא קשר למלאי אגוניסט או ספק. חשוב לציין, שיטה זו ישימה עבור אגוניסטים טסיות אחרים, ואכן, מולקולות ביולוגיות רבות אחרות bioassays.
התהליך המתואר להלן כולל ביצוע סדרת דילול של 6-8 נקודות של ה”תקן” וה”מבחן” (החומר שאתה בודק) והרצתם זה לצד זה בבדיקה נבחרת (במקרה זה, LTA). CRP-XL משמש בריכוזי מסה/נפח, אך לא כל חומר נותן את אותה פעילות ביולוגית בריכוז נתון, ולכן נעשית סדרת דילול כדי להשוות את החומר הסטנדרטי וחומר הבדיקה ולקבוע איזה ריכוז נדרש כדי לתת פעילות מקבילה. סדרת הדילול חייבת להשתרע על פני 0-100% צבירה. הנתונים מתווטים באמצעות רגרסיה לא ליניארית, ונקבע ערך EC50 של כל מדגם (תקן ומבחן). כדי להקצות פעילות, חלק את ערך EC50 של התקן בזה של הבדיקה כדי לקבוע כמה חזק יותר או פחות הוא ולהתאים את הריכוז בהתאם. גישה זו תבטיח שאותה “פעילות” ביולוגית תתווסף לבדיקה שוב ושוב.
Introduction
רבים מאיתנו משתמשים באגוניסטים ביולוגיים ובאנטגוניסטים בניסויים שלנו, לרוב בבדיקה ביולוגית המכמתת את השפעתם על תפקוד התא בתנאים מסוימים. השיטה המתוארת כאן היא עבור אגוניסט טסיות פפטיד הקשור לקולגן (CRP-XL), אגוניסט לגליקופרוטאין VI המפעיל טסיות דם ופעילותו ניתנת למדידה במגוון בדיקות (אגרגומטריה של העברת אור, מיקרוסקופיה, ציטומטריית זרימה, שחרור Ca2+ וכו’), אך פרוטוקול התקינה האגוניסטי חל על כל אגוניסט/אנטגוניסט ביולוגי ו/או ביואסי. המדעים הפיזיקליים בקיאים בשימוש בתקנים בפרקטיקות העבודה היומיומיות שלהם, וחברות המפתחות תרופות ביותרפיות במגזר המסחרי מבינות את הערך של שימוש בתקני ייחוס1, אך הם עדיין אינם מנוצלים מספיק על ידי מדענים ביולוגיים רבים, במיוחד בקהילת המחקר האקדמית, וחוסר השימוש בהם משפיע לרעה על איכות התפוקה המדעית.
CRP-XL הוא אגוניסט ספציפי ספציפי ל-GPVI ששדה הטסיות השתמש בו במשך עשרות שנים מאז תיאורו בשנת 19952, ומסייע לקהילה להגדיר את תפקיד GPVI מזה של חלבוני טסיות קושרי קולגן אחרים מאז 3,4. אגוניסט זה ניתן לרכוש ממגוון רחב של מקורות מסחריים או מיוצר בתוך הבית. מונומר פפטיד ניתן לרכוש מספק ולאחר מכן cross-linked בתוך הבית או שזה יכול להיעשות על ידי הספק תמורת תשלום נוסף. חיסכון נוסף בעלויות יכול להתבצע על ידי הפחתת הטוהר הנדרש בעת המשלוח (70% לעומת 95%, למשל). כמו כן, אין הסכמה על אופן האחסון של CRP-XL, כאשר חלקם בוחרים באחסון בהקפאה ואחרים בקירור, חלקם שומרים על החומר עד לשימוש, ואחרים מאחסנים אותו בתמיסה (מים או חיץ, בהתאם להעדפה). לכן, האיכות וההרכב של מלאי המעבדה אינם סטנדרטיים או הרמוניים. מכיוון שאגוניסט זה משמש בריכוז מוגדר (מסה/נפח) ולא ביחידות פעילות, העוצמה של CRP-XL במעבדה אחת, למשל ב-1 מיקרוגרם/מ”ל, לא תהיה זהה לאחרת. ראוי לציין כי אגוניסטים טסיות אחרים המשמשים בתחום הם כבר סטנדרטיים (למשל, טרומבין, אשר מסופק ומשמש ביחידות פעילות ולא מסה / נפח), ולכן התנועה ממסה / נפח ליחידות ביולוגיות לא צריך להיות מאתגר מדי עבור הקהילה. כמו כן, יש לציין כי תגובות המטופלים לאגוניסטים של טסיות הדם, כולל CRP-XL, משתנות מבחינת רגישותם לאגוניסטים כמו גם מבחינת יכולתם להגיב (מידת התגובה)5, ולכן חשוב עוד יותר להשתמש בכמויות עקביות של פעילות אגוניסטית בבדיקות.
אם ניתן ליצור הרמוניה בין אגוניסטים לטסיות דם על ידי שימוש בהם בפעילות מוגדרת ולא במשקל/נפח, ניתן להבטיח שניסוי במעבדה אחת יהיה דומה ישירות לניסוי במעבדות אחרות וניתן יהיה לשחזר אותו במדויק בביטחון. עד שהשטח יגיע להסכמה כיצד לאחסן ולתקנן את פעילות CRP-XL, חיוני לבצע בדיקות שוטפות על החומר כדי להבטיח את עקביותו לאורך החודשים / השנים בהם נעשה בו שימוש.
הקצאת ערך פעילות לתקנים ביולוגיים חייבת להיעשות באמצעות מחקרים שיתופיים ורב-מרכזיים (לדוגמה 6,7) ודורשת מומחיות מומחה. הצורך בסטנדרטים ביולוגיים מבוססים לאגוניסטים לטסיות הודגש לאחרונה על ידי מחקר רב-מרכזי משותף8 הנתמך על ידי האגודה הבינלאומית לפקקת והמוסטזיס (ISTH); עד שיהיה תקן CRP-XL בינלאומי זמין, החוקרים יכולים לתקנן את החומר שלהם באופן מקומי כדי להבטיח עקביות לאורך זמן, ושחומר חדש שמקורו מסחרי או פנימי הוא בעל פעילות דומה להכנות קודמות, כמו גם לשאר הקהילה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שמוצג כאן, תהליך הסטנדרטיזציה של החומרים הוא פשוט מאוד. למרות שנדרש מעט זמן להעריך אצוות חדשות של חומר ו/או לבדוק שהאצווה הנוכחית יציבה ולא מאבדת פעילות לאורך זמן, התגמול הוא שהניסויים ניתנים לשחזור פעם אחר פעם וניתנים להשוואה לאורך שנים ולא רק לאורך החיים של אצווה של מגיב. זה גם אומר שחוקרים אחרים יכולים לשחזר במדויק את תנאי הבדיקה ושהקהילה הרמונית ברמה העולמית. השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים איסוף דם מלא והכנת PRP9, כמו גם דיוק בעת ביצוע סדרת הדילול. חשוב גם לוודא שעקומות הבדיקה והתקן מקבילות לפני שממשיכים בהשוואה EC50 . אם הקווים אינם מקבילים, או שהאסימפטוטים אינם שקולים, זה יכול להצביע על כך שהבדיקה והחומר הסטנדרטי שונים במידה מסוימת.
כל מי שעובד במדעי הביולוגיה יודע שבדיקות ביולוגיות לא תמיד מתפקדות באופן עקבי, ולכן יש לשים לב לכך בעת הערכת הנתונים. בדוגמה המוצגת כאן, למרות שאנו משתמשים באותם תורמים כדי למדוד את עוצמתם של שני חומרים דומים מאוד, אם לא זהים, מדרונות הגבעות והאסימפטוטים אינם זהים. עם זאת, אנו מקבלים מידה מסוימת של שונות ומסיקים כי העקומות הן, במקרה זה, מקבילות, ולכן מתאימות להשוואה והתאמה של עוצמה. מולקולות ביולוגיות הן גדולות ומורכבות, ושינויים שלאחר התרגום במהלך הייצור יכולים להשפיע על עוצמתן בבדיקות ביולוגיות. סטנדרטיזציה של ביומולקולות ובדיקות ביולוגיות אינה יכולה להיעשות באמצעות מסה או נפח בלבד, ויש לעשות זאת על ידי כימות והשוואה של פעילות ביולוגית בביו-אסאי11. יש להשתמש בהכשרתו ובניסיונו כדי להעריך את הנתונים בהקשר של הבדיקה.
מגבלות הטכניקה הן שבעוד שהנתונים עשויים להצביע על בעיה בריאגנטים, הם אינם יכולים לומר לך מה הבעיה. עבודה נוספת תידרש כדי לקבוע מדוע החומרים אינם דומים. בעולם אידיאלי, כל חומר קריטי לניסוי(ים) ולמסקנות מדעיות לאחר מכן יאומת על ידי ספקטרוסקופיית מסות, אך זו לא תמיד אופציה. עם זאת, אם הנתונים אינם ברי השוואה, חקירה נוספת עדיין נדרשת במידה מסוימת. מגבלה נוספת של גישה זו היא הזמן והמשאבים הדרושים כדי לעשות זאת. באופן אידיאלי, יש להשוות את הבדיקה ואת התקן ב 3-6 תורמים כדי לספק ביטחון מסוים בהקצאת פעילות ביולוגית לחומר, אך אנו מרגישים שזה מוצדק על ידי תמיכה בשחזור ואמינות. סטנדרטיזציה של חומר ביולוגי אינה נחוצה בכל פעם שניסויים מתבצעים, אך לכל הפחות, יש לעשות זאת עבור כל אצווה חדשה של אגוניסטים, רצוי בתדירות גבוהה יותר, בהתאם ליציבות ולשימוש. אכן, אם יהיה תקן זמין, זה משהו שארגוני תקינה בינלאומיים יכולים לספק בהירות לגביו.
בעוד שהדוגמה המוצגת כאן היא עבור CRP-XL בהקשר של מדידת צבירת טסיות, פרוטוקול השוואת הפעילות הביולוגית של ביומולקולות בבדיקות ביולוגיות ישים באופן נרחב בכל המגזר.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
| 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
| Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Prism | Graphpad | Analysis software package | |
| Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |
References
- Faya, P., et al. Potency assignment of biotherapeutic reference standards. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577 (2020).
- Morton, L. F., et al. Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity. The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).
- Pugh, N., et al. Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood. Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).
- Farndale, R. W., et al. Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).
- Dunster, J. L., et al. Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts. Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).
- Hubbard, A. R., et al. Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).
- Sergaki, C., et al. Developing whole cell standards for the microbiome field. Microbiome. 10 (1), 123 (2022).
- Alessi, M. C., et al. Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).
- Taylor, L., et al. Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing. PLoS One. 9 (6), e101209 (2014).
- Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. Applying the science of measurement to biology: Why bother. PLoS Biology. 17 (6), e3000338 (2019).
