生物学的標準を用いた研究における再現性と調和:血小板アゴニストコラーゲン関連ペプチドの例
Summary
ここでは、光透過凝集法を用いて血小板アゴニストのコラーゲン関連ペプチド架橋(CRP-XL)を標準化する方法を紹介します。プロトコルが血小板機能を目標としている間、実験プロセスは科学的な厳密さおよび再現性を保障するためにほとんどの生物的分子および生物検定に適用することができる。
Abstract
計測学(測定の科学)は、生物学者にとって不利益なほどに、ほとんど教えられないテーマです。シンプルな標準化プロセスを日常業務に適用することで、距離や時間にわたってデータに信頼性と再現性を持たせることができます。
この方法は、止血研究や臨床診療で広く使用されているコアラボ実験、具体的には、光透過凝集法(LTA)による血小板コラーゲン受容体(糖タンパク質[GP]VI)アゴニストコラーゲン関連ペプチド架橋(CRP-XL)への応答の測定を標準化する方法を示しています。このアプローチを使用することで、アゴニストの在庫やサプライヤーに関係なく、ラボ内の再現性とラボ間の調和が保証されます。重要なことに、この方法は他の血小板アゴニスト、そして実際、他の多くの生体分子やバイオアッセイにも適用できます。
以下に概説するプロセスでは、「標準」と「テスト」(チェックする材料)の6〜8ポイント希釈シリーズを作成し、選択したアッセイ(この場合はLTA)で並べて実行します。CRP-XLは質量/体積濃度で使用されますが、すべての材料が特定の濃度で同じ生物活性を示すわけではないため、希釈シリーズを作成して標準物質と試験物質を比較し、同等の活性を得るために必要な濃度を決定します。希釈系列は、0〜100%の凝集にまたがる必要があります。データは非線形回帰を使用してプロットされ、各サンプル(標準およびテスト)のEC50 値が決定されます。活性を割り当てるには、標準試料の EC50 値を試験値で割って、その効力の増減を判断し、それに応じて濃度を調整します。このアプローチにより、同じ生物学的「活性」がアッセイに何度も追加されることが保証されます。
Introduction
私たちの多くは、実験で生物学的アゴニストとアンタゴニストを使用し、ほとんどの場合、特定の条件下で細胞機能への影響を定量化する生物学的アッセイで使用します。本稿に記載の方法は、血小板を活性化し、その活性を種々のアッセイ(光透過凝集法、顕微鏡法、フローサイトメトリー、Ca2+ 放出など)で測定することができる糖タンパク質VIアゴニストである血小板アゴニストコラーゲン関連ペプチド架橋(CRP-XL)のためのものであるが、アゴニスト標準化プロトコルは、あらゆる生物学的アゴニスト/アンタゴニストおよび/またはバイオアッセイに適用可能である。物理科学は、日常業務における標準物質の使用に精通しており、商業部門でバイオ医薬品を開発している企業は、標準物質1を使用することの価値を理解していますが、多くの生物学者、特に学術研究コミュニティでは、標準物質が十分に活用されておらず、使用されていないことが科学的成果の質に悪影響を及ぼしています。
CRP-XLは、1995年の記述以来、血小板分野で数十年にわたって使用されてきた特異的なGPVI特異的アゴニストであり2、GPVIの役割を他のコラーゲン結合血小板タンパク質の役割から区別するのに役立っています3,4。このアゴニストは、さまざまな商業的供給源から調達することも、社内で製造することもできます。ペプチドモノマーは、サプライヤーから購入し、社内で架橋することも、サプライヤーが追加料金で行うこともできます。納品時に必要な純度を下げることで、さらなるコスト削減が可能です(たとえば、95%に対して70%)。また、CRP-XLの保存方法についてもコンセンサスが得られておらず、凍結保存を選択する人もいれば、冷蔵保存を選択する人もいれば、使用まで凍結乾燥する人もいれば、溶液(好みに応じて水または緩衝液)で保存する人もいます。したがって、ラボストックの品質と組成は標準化されておらず、調和していません。このアゴニストは活性単位ではなく定義された濃度(質量/体積)で使用されるため、あるラボ(例えば1 μg/mL)でのCRP-XLの効力は、別のラボと同じにはなりません。この分野で使用されている他の血小板アゴニストはすでに標準化されているため(例えば、トロンビンは質量/体積ではなく活性単位で供給および使用される)、質量/体積から生物学的単位への移行は、コミュニティにとってそれほど困難ではないはずです。また、CRP-XLを含む血小板アゴニストに対する患者の反応は、アゴニストに対する感受性や反応能力(奏効の程度)の点で変動するため5、アッセイで一貫した量のアゴニスト活性を使用することがさらに重要であることにも注意する必要があります。
血小板アゴニストを重量/体積ではなく、定義された活性で使用することで調和させることができれば、あるラボでの実験が他のラボでの実験と直接比較でき、自信を持って正確に再現できるようになります。CRP-XL活性の保存方法と標準化方法について分野が合意に達するまでは、材料を定期的にチェックして、使用されている数か月/数年にわたる一貫性を確保することが不可欠です。
生物学的標準物質の活性値の割り当ては、共同の多施設研究(6,7など)を通じて行う必要があり、専門知識が必要です。血小板作動薬の確立された生物学的基準の必要性は、最近、国際血栓止血学会(ISTH)が支援する共同多施設研究8によって強調されています。CRP-XLの国際標準が利用可能になるまで、研究者は独自の材料をローカルで標準化して、長期にわたる一貫性を確保し、商業的または社内で調達された新しい材料は、以前の準備やコミュニティの他の準備に匹敵する活動を行うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに示すように、材料を標準化するプロセスは非常に簡単です。新しいバッチの材料を評価したり、現在のバッチが安定していて、時間の経過とともに活性が失われていないことを確認したりするには少し時間がかかりますが、その見返りは、実験が何度も再現可能であり、試薬のバッチの寿命だけでなく、何年にもわたって比較できることです。また、他の研究者がアッセイ条件を正確に再現でき、コミュニティがグローバルレベルで調和していることも意味します。プロトコルの重要なステップには、全血採取とPRP調製9、および希釈シリーズを作成する際の精度が含まれます。また、EC50 の比較を進める前に、テスト曲線と検量線が平行であることを確認することも重要です。線が平行でない場合、または漸近線が同等でない場合は、試験材料と標準材料がある程度異なることを示している可能性があります。
生物科学に携わる人なら誰でも、生物学的アッセイが常に一貫して機能するとは限らないことを知っているため、データを評価する際にはこの点に注意する必要があります。ここに示す例では、同一ではないにしても非常によく似た 2 つの材料の効力を測定するために同じドナーを使用していますが、丘陵の斜面と漸近線は同一ではありません。しかし、ある程度のばらつきを受け入れ、この場合、曲線は平行であり、したがって効力の比較と調整に適していると結論付けます。生体分子は大きく複雑であり、製造中の翻訳後修飾がバイオアッセイにおけるその効力に影響を与える可能性があります。生体分子とバイオアッセイの標準化は、質量や体積だけでは行えず、バイオアッセイにおける生物 活性 の定量化と比較によって行う必要があります11。1つは、アッセイのコンテキストでデータを評価するために彼/彼女のトレーニングと経験を使用する必要があります。
この手法の限界は、データが試薬の問題を示していることはあっても、問題が何であるかを知ることができないことです。材料が比較できない理由を特定するには、さらなる作業が必要です。理想的な世界では、実験とその後の科学的結論に不可欠な材料は質量分析法によって検証されますが、これは常にオプションであるとは限りません。ただし、データが比較できない場合でも、ある程度の範囲でさらなる調査が必要です。このアプローチのもう一つの制限は、それを行うために必要な時間とリソースです。理想的には、3〜6人のドナーで試験と標準を比較して、材料に生物学的活性を割り当てることにある程度の信頼性を提供する必要がありますが、これは再現性と信頼性をサポートすることで正当化されると考えています。生物学的物質の標準化は、実験を実行するたびに必要というわけではありませんが、少なくとも、安定性と用途に応じて、アゴニストの新しいバッチごとに、できればより頻繁に行う必要があります。実際、規格が利用可能になれば、国際標準化団体が明確にすることができます。
ここで示した例は、血小板凝集を測定する際のCRP-XLに関するものですが、バイオアッセイにおける生体分子の生物学的活性を比較するプロトコルは、この分野に広く適用できます。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ。
Materials
| 4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
| 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
| Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Prism | Graphpad | Analysis software package | |
| Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |
References
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