Reproduceerbaarheid en harmonisatie in onderzoek met behulp van biologische standaarden: het voorbeeld van bloedplaatjesagonist collageen-gerelateerd peptide
Summary
Hier presenteren we een methode om de bloedplaatjesagonist collageen-gerelateerd peptide cross-linked (CRP-XL) te standaardiseren met behulp van lichttransmissie-aggregometrie. Hoewel het protocol gericht is op de bloedplaatjesfunctie, kan het experimentele proces worden toegepast op de meeste biologische moleculen en bioassays om wetenschappelijke nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te garanderen.
Abstract
Metrologie – de wetenschap van de maat – is een onderwerp waarover maar weinig biologische wetenschappers in hun opleiding worden onderwezen, tot hun nadeel; De toepassing van eenvoudige standaardisatieprocessen op de dagelijkse werkpraktijk zorgt voor vertrouwen in gegevens en reproduceerbaarheid over afstand en tijd.
Deze methode laat zien hoe een kernlaboratoriumexperiment kan worden gestandaardiseerd dat veel wordt gebruikt in hemostaseonderzoek en klinische praktijk, met name het meten van reacties op de bloedplaatjescollageenreceptor (glycoproteïne [GP]VI) agonist collageengerelateerd peptide, verknoopt (CRP-XL) door lichttransmissie-aggregometrie (LTA). Het gebruik van deze aanpak zorgt voor reproduceerbaarheid binnen het laboratorium en harmonisatie tussen laboratoria, ongeacht de voorraad agonisten of leveranciers. Belangrijk is dat deze methode toepasbaar is op andere bloedplaatjesagonisten en, inderdaad, vele andere biologische moleculen en bioassays.
Het hieronder beschreven proces omvat het maken van een 6-8-punts verdunningsreeks van de ‘standaard’ en de ‘test’ (het materiaal dat u controleert) en deze naast elkaar te laten lopen in een gekozen test (in dit geval LTA). CRP-XL wordt gebruikt bij massa/volumeconcentraties, maar niet elk materiaal geeft dezelfde biologische activiteit bij een bepaalde concentratie, dus wordt een verdunningsreeks gemaakt om het standaard- en testmateriaal te vergelijken en te bepalen welke concentratie nodig is om een gelijkwaardige activiteit te geven. De verdunningsreeks moet 0-100% aggregatie omvatten. De gegevens worden uitgezet met behulp van niet-lineaire regressie en de EC50-waarde van elk monster (standaard en test) wordt bepaald. Om activiteit toe te wijzen, deelt u de EC50-waarde van de norm door die van de test om te bepalen hoeveel meer of minder krachtig deze is en past u de concentratie dienovereenkomstig aan. Deze aanpak zorgt ervoor dat steeds weer dezelfde biologische ‘activiteit’ aan de test wordt toegevoegd.
Introduction
Velen van ons gebruiken biologische agonisten en antagonisten in onze experimenten, meestal in een biologische test die hun effect op de celfunctie onder specifieke omstandigheden kwantificeert. De hier beschreven methode is voor de bloedplaatjesagonist collageengerelateerd peptide, cross-linked (CRP-XL), een glycoproteïne VI-agonist die bloedplaatjes activeert en waarvan de activiteit kan worden gemeten in verschillende assays (lichttransmissie-aggregometrie, microscopie, flowcytometrie, Ca2+ -afgifte, enz.), maar het agonist-standaardisatieprotocol is van toepassing op elke biologische agonist/antagonist en/of bioassay. De natuurwetenschappen zijn goed thuis in het gebruik van normen in hun dagelijkse werkpraktijken, en bedrijven die biotherapeutische geneesmiddelen ontwikkelen in de commerciële sector begrijpen de waarde van het gebruik van referentienormen1, maar ze blijven onderbenut door veel biologische wetenschappers, vooral in de academische onderzoeksgemeenschap, en hun gebrek aan gebruik heeft een negatieve invloed op de kwaliteit van de wetenschappelijke output.
CRP-XL is een specifieke GPVI-specifieke agonist die het bloedplaatjesveld al tientallen jaren gebruikt sinds de beschrijving in 19952, waardoor de gemeenschap de rol van GPVI kan onderscheiden van die van andere collageenbindende bloedplaatjeseiwitten sinds 3,4. Deze agonist kan uit verschillende commerciële bronnen worden verkregen of in eigen huis worden geproduceerd. Het peptidemonomeer kan worden ingekocht bij een leverancier en vervolgens in eigen beheer worden verknoopt of dit kan tegen een extra vergoeding door de leverancier worden gedaan. Verdere kostenbesparingen kunnen worden gerealiseerd door de vereiste zuiverheid bij levering te verminderen (bijvoorbeeld 70% versus 95%). Er is ook geen consensus over hoe CRP-XL moet worden bewaard, sommigen kiezen voor cryo-opslag en anderen voor koeling, sommigen houden het materiaal gevriesdroogd tot gebruik, en anderen bewaren het in oplossing (water of buffer, afhankelijk van de voorkeur). Daarom zijn de kwaliteit en samenstelling van laboratoriumvoorraden niet gestandaardiseerd of geharmoniseerd. Omdat deze agonist wordt gebruikt in een bepaalde concentratie (massa/volume) in plaats van in eenheden van activiteit, zal de potentie van CRP-XL in het ene laboratorium, bijvoorbeeld bij 1 μg/ml, niet hetzelfde zijn als in een ander. Het is vermeldenswaard dat andere bloedplaatjesagonisten die in het veld worden gebruikt, al gestandaardiseerd zijn (bijv. trombine, dat wordt geleverd en gebruikt in eenheden van activiteit in plaats van massa/volume), dus de beweging van massa/volume naar eenheden van biologische zou niet al te uitdagend moeten zijn voor de gemeenschap. Er moet ook worden opgemerkt dat de respons van patiënten op bloedplaatjesagonisten, waaronder CRP-XL, variabel is in termen van hun gevoeligheid voor agonisten en hun reactievermogen (mate van respons)5, dus het is nog belangrijker om consistente hoeveelheden agonistactiviteit in de tests te gebruiken.
Als bloedplaatjesagonisten kunnen worden geharmoniseerd door ze te gebruiken bij een gedefinieerde activiteit in plaats van gewicht/volume, kan ervoor worden gezorgd dat een experiment in het ene laboratorium direct vergelijkbaar is met dat in andere laboratoria en nauwkeurig en met vertrouwen kan worden gereproduceerd. Totdat het veld overeenstemming bereikt over hoe CRP-XL-activiteit moet worden opgeslagen en gestandaardiseerd, is het essentieel om regelmatig controles uit te voeren op het materiaal om de consistentie ervan te garanderen gedurende de maanden/jaren waarin het wordt gebruikt.
De toewijzing van activiteitswaarden voor biologische standaarden moet worden gedaan door middel van collaboratieve, multicenter studies (bijvoorbeeld 6,7) en vereist specialistische expertise. De noodzaak van vastgestelde biologische normen voor bloedplaatjesagonisten is onlangs benadrukt door een gezamenlijke multicenter studie8 ondersteund door de International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH); totdat er een internationale CRP-XL-standaard beschikbaar is, kunnen onderzoekers hun eigen materiaal lokaal standaardiseren om consistentie in de loop van de tijd te garanderen, en dat nieuw materiaal dat commercieel of intern wordt ingekocht, is van vergelijkbare activiteit als eerdere preparaten, evenals die van de rest van de gemeenschap.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals hier te zien is, is het proces van het standaardiseren van de materialen heel eenvoudig. Hoewel het een beetje tijd kost om nieuwe partijen materiaal te evalueren en/of om te controleren of de huidige partij stabiel is en na verloop van tijd geen activiteit verliest, is de beloning dat experimenten keer op keer reproduceerbaar zijn en over jaren vergelijkbaar zijn in plaats van alleen de levensduur van een partij reagens. Het betekent ook dat andere onderzoekers de testomstandigheden nauwkeurig kunnen nabootsen en dat de gemeenschap op mondiaal niveau wordt geharmoniseerd. Cruciale stappen in het protocol zijn onder meer volbloedafname en PRP-bereiding9, evenals precisie bij het maken van de verdunningsreeks. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de test- en standaardcurven parallel lopen voordat u doorgaat met de EC50-vergelijking . Als de lijnen niet evenwijdig zijn, of als de asymptoten niet gelijkwaardig zijn, kan dit erop wijzen dat het test- en standaardmateriaal tot op zekere hoogte verschillen.
Iedereen die in de biologische wetenschappen werkt, weet dat biologische tests niet altijd consistent presteren, dus men moet hier rekening mee houden bij het evalueren van de gegevens. In het hier getoonde voorbeeld, hoewel we dezelfde donoren gebruiken om de potentie van twee zeer vergelijkbare, zo niet identieke, materialen te meten, zijn de heuvelhellingen en asymptoten niet identiek. Toch accepteren we een zekere mate van variabiliteit en concluderen we dat de curves in dit geval parallel zijn, en daarom geschikt om de potentie te vergelijken en aan te passen. Biologische moleculen zijn groot en complex, en posttranslationele modificaties tijdens de productie kunnen hun potentie in bioassays beïnvloeden. Het standaardiseren van biomoleculen en bioassays kan niet worden gedaan met alleen massa of volume en moet worden gedaan door de biologische activiteit in een bioassay te kwantificeren en te vergelijken11. Men moet zijn/haar opleiding en ervaring gebruiken om de gegevens in de context van de test te evalueren.
Beperkingen van de techniek zijn dat hoewel de gegevens kunnen wijzen op een probleem met het (de) reagens(en), het u niet kan vertellen wat het probleem is. Verder onderzoek zal nodig zijn om vast te stellen waarom de materialen niet vergelijkbaar zijn. In een ideale wereld zou elk materiaal dat cruciaal is voor experiment(en) en daaropvolgende wetenschappelijke conclusies worden geverifieerd door middel van massaspectroscopie, maar dit is niet altijd een optie. Als de gegevens echter niet vergelijkbaar zijn, is verder onderzoek in een bepaalde hoedanigheid nog steeds gerechtvaardigd. Een andere beperking van deze aanpak is de tijd en middelen die nodig zijn om het te doen. Idealiter zouden de test en de standaard moeten worden vergeleken bij 3-6 donoren om enig vertrouwen te geven in het toekennen van biologische activiteit aan het materiaal, maar we zijn van mening dat dit gerechtvaardigd is door reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid te ondersteunen. Het standaardiseren van biologisch materiaal is niet elke keer nodig wanneer experimenten worden uitgevoerd, maar het moet op zijn minst worden gedaan voor elke nieuwe batch agonisten, bij voorkeur vaker, afhankelijk van de stabiliteit en het gebruik. Mocht er een norm beschikbaar komen, dan is dit iets waar internationale normalisatie-instellingen duidelijkheid over kunnen verschaffen.
Hoewel het hier getoonde voorbeeld voor CRP-XL is in de context van het meten van bloedplaatjesaggregatie, is het protocol voor het vergelijken van de biologische activiteit van biomoleculen in bioassays breed toepasbaar in de hele sector.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| 4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
| 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
| Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Prism | Graphpad | Analysis software package | |
| Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |
References
- Faya, P., et al. Potency assignment of biotherapeutic reference standards. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577 (2020).
- Morton, L. F., et al. Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity. The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).
- Pugh, N., et al. Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood. Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).
- Farndale, R. W., et al. Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).
- Dunster, J. L., et al. Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts. Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).
- Hubbard, A. R., et al. Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).
- Sergaki, C., et al. Developing whole cell standards for the microbiome field. Microbiome. 10 (1), 123 (2022).
- Alessi, M. C., et al. Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).
- Taylor, L., et al. Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing. PLoS One. 9 (6), e101209 (2014).
- Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. Applying the science of measurement to biology: Why bother. PLoS Biology. 17 (6), e3000338 (2019).
