Reproducibilidad y armonización en la investigación utilizando estándares biológicos: el ejemplo del péptido relacionado con el colágeno agonista plaquetario

La sangre debe extraerse de voluntarios sanos que den su consentimiento y procesarse de acuerdo con las normas locales. Este protocolo mide la agregación plaquetaria inducida por agonistas en plasma rico en plaquetas (PRP) mediante aggregometría de transmisión de luz (LTA). La ISTH proporciona protocolos estandarizados, incluido un método de 2013 para la preparación de PRP y LTA9.  Recolectar sangre entera en citrato de sodio al 4% según las recomendaciones de ISTH de acuerdo con las reglas del comité de ética local. Excluya a los donantes que hayan tomado AINE en las últimas 2 semanas. 1. Procedimiento de ensayo Tome una alícuota de stock de CRP-XL y dilúyala en tampón de ensayo (Tyrodes10) (Tabla 1) hasta una concentración inicial que provoque la máxima agregación (consulte la NOTA a continuación del paso 1.3).NOTA: En la literatura, una concentración de 1 μg/mL inducirá la máxima agregación, pero algunos laboratorios necesitan concentraciones más altas para alcanzar el mismo efecto: ajuste la serie de dilución en consecuencia Realice una serie de diluciones correspondiente con el patrón (consulte la NOTA a continuación del paso 1.3 y la Figura 1) de modo que las concentraciones sean las mismas que las del reactivo de ensayo. Producir una serie de diluciones de 6 a 8 puntos para la prueba y el patrón, de nuevo en tampón de ensayo, que lleve la respuesta de agregación del 100 % al 0 % de agregación. En la Tabla 2 se muestra un ejemplo que muestra una curva de concentración de una serie de diluciones de 8 puntos.NOTA: Algunos laboratorios agregan agonista a un volumen total de ensayo del 10%, por ejemplo, 50 μL de agonista a 450 μL de plaquetas, de modo que diluyen una concentración de 10x a una concentración final de 1x en el ensayo, mientras que otros agregan volúmenes más pequeños (más concentrados) de agonista, por ejemplo, 5 μL de agonista a 495 μL de plaquetas; solo asegúrese de que la serie de dilución sea apropiada para el ensayo teniendo en cuenta cómo el desplazamiento de volumen Afecta la concentración de plaquetas, de nuevo, sé constante. En el ejemplo, se añaden 30 μL de agonista 10x a 270 μL de plasma rico en plaquetas (PRP). Una vez que las plaquetas estén reposadas y listas para usar, alícuotas en cubetas LTA, agregue una barra de agitación y deje que alcancen los 37 ° C en los pocillos de retención. Una vez que esté a temperatura, coloque la(s) cubeta(s) en el agregador y comience a registrar la(s) traza(s). Agregue el agonista (con agitación) y registre los datos. Repita el paso 1.4 para cada concentración de la prueba y el patrón hasta que se hayan recopilado los datos necesarios para trazar las curvas (curvas de ejemplo que se muestran en la Figura 2). Calcular la potencia del reactivo de prueba en relación con la del patrón; Una vez más, utilice cualquier métrica (agregación máxima o área bajo la curva), siempre que haya coherencia y el modelo de análisis se ajuste adecuadamente a los datos. 2. Comprobación de las curvas de concentración En primer lugar, compruebe que las curvas de respuesta a la concentración son paralelas. Hay muchos paquetes de software que hacen esto, pero aquí se describe el proceso para Graphpad Prism (consulte la Figura 3).Introduzca los datos de modo que log(concentración) esté en el eje X y la respuesta (% de agregación máxima/AUC) esté en el eje Y (Figura 3A) Concentraciones transformadas de CRP-XL (Figura 3B) Seleccione Regresión no lineal en las funciones de análisis y utilice la ecuación para la estimulación/inhibición dosis-respuesta. Seleccione log (agonista) frente a respuesta (pendiente variable): use el ajuste de 3 o 4 vías según cuál sea mejor para los datos. Determine si las curvas son paralelas utilizando la pestaña Comparar (como se muestra en la Figura 3C) y haga clic en el botón para comparar los datasets y asegurarse de que la pendiente (pendiente de la colina) y las asíntotas (la parte superior e inferior de las curvas) sean equivalentes. En este ejemplo, la pendiente de Hill para la prueba es 2.279 y la del estándar es 2.025, lo que da una relación de 1.125. Si las pendientes son paralelas (por ejemplo, un criterio de aceptación de la relación de pendiente entre 0,8 y 1,25) y las asíntotas son equivalentes, se procederá al cálculo de la potencia (EC50) utilizando los pasos 2.1.3 y 2.1.4. En el ejemplo que se muestra aquí, las asíntotas se han restringido ya que la evaluación en el paso 2.1.5 confirmó que las asíntotas son equivalentes. Divida el valor EC50 del patrón por el de la prueba para determinar la potencia relativa. En el ejemplo que se muestra aquí, test/standard (0.07259/0.1498) = 0.4846, es decir, la ‘prueba’ es la mitad de potente que el estándar. Ajustar las concentraciones de masa/volumen para tener en cuenta la diferencia de potencia, es decir, si el patrón se utilizó anteriormente a 1 μg/mL, el nuevo material se utilizaría a 1/0,4846 = 2,063 μg/mL) para garantizar que se utilicen cantidades comparables de material activo en los experimentos