Biyolojik Standartlar Kullanılarak Yapılan Araştırmalarda Tekrarlanabilirlik ve Uyum: Trombosit Agonisti Kollajen İlişkili Peptit Örneği
Summary
Burada, ışık geçirgenlik agregometrisi kullanarak trombosit agonisti kollajen ile ilişkili peptit çapraz bağlı (CRP-XL) standardize etmek için bir yöntem sunuyoruz. Protokol trombosit fonksiyonunu hedeflerken, deneysel süreç, bilimsel titizlik ve tekrarlanabilirliği sağlamak için çoğu biyolojik moleküle ve biyo-tahlillere uygulanabilir.
Abstract
Metroloji – ölçü bilimi – çok az biyolojik bilim insanının eğitimlerinde kendi zararlarına öğretildiği bir konudur; Basit standardizasyon süreçlerinin günlük çalışma uygulamalarına uygulanması, verilere güven ve mesafe ve zaman içinde tekrarlanabilirlik sağlar.
Bu yöntem, hemostaz araştırmalarında ve klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan bir çekirdek laboratuvar deneyinin nasıl standartlaştırılacağını, özellikle trombosit kollajen reseptörüne (glikoprotein [GP]VI) agonist kollajenle ilişkili peptit, çapraz bağlı (CRP-XL) ışık geçirgenlik agregometrisi (LTA) ile yanıtların nasıl standartlaştırılacağını gösterir. Bu yaklaşımın kullanılması, agonist stoğu veya tedarikçisinden bağımsız olarak laboratuvar içi tekrarlanabilirliği ve laboratuvarlar arası uyumu sağlayacaktır. Daha da önemlisi, bu yöntem diğer trombosit agonistlerine ve aslında diğer birçok biyolojik moleküle ve biyo-tahlillere uygulanabilir.
Aşağıda özetlenen işlem, ‘standart’ ve ‘test’in (kontrol ettiğiniz malzeme) 6-8 noktalı bir seyreltme serisinin yapılmasını ve bunların seçilen bir tahlilde (bu durumda LTA) yan yana çalıştırılmasını içerir. CRP-XL, kütle/hacim konsantrasyonlarında kullanılır, ancak her malzeme belirli bir konsantrasyonda aynı biyolojik aktiviteyi vermez, bu nedenle standart ve test malzemesini karşılaştırmak ve eşdeğer aktivite vermek için hangi konsantrasyonun gerekli olduğunu belirlemek için bir seyreltme serisi yapılır. Seyreltme serisi %0-100 agregasyonu kapsamalıdır. Veriler doğrusal olmayan regresyon kullanılarak çizilir ve her numunenin (standart ve test) EC50 değeri belirlenir. Aktivite atamak için, standardın EC50 değerini, ne kadar az ya da çok etkili olduğunu belirlemek için testin değerine bölün ve konsantrasyonu buna göre ayarlayın. Bu yaklaşım, aynı biyolojik ‘aktivitenin’ teste tekrar tekrar eklenmesini sağlayacaktır.
Introduction
Birçoğumuz deneylerimizde, çoğunlukla belirli koşullar altında hücre fonksiyonu üzerindeki etkilerini ölçen biyolojik bir tahlilde biyolojik agonistler ve antagonistler kullanırız. Burada tarif edilen yöntem, trombositleri aktive eden ve aktivitesi çeşitli tahlillerde (ışık geçirgenliği agregometrisi, mikroskopi, akış sitometrisi, Ca2+ salımı, vb.) ölçülebilen bir glikoprotein VI agonisti olan trombosit agonisti kollajen ile ilişkili peptit, çapraz bağlı (CRP-XL) içindir, ancak agonist standardizasyon protokolü herhangi bir biyolojik agonist/antagonist ve/veya biyoassay için geçerlidir. Fiziksel bilimler, günlük çalışma uygulamalarında standartların kullanımı konusunda çok bilgilidir ve ticari sektörde biyoterapötik ilaçlar geliştiren şirketler, referans standartları1 kullanmanın değerini anlamaktadır, ancak birçok biyolojik bilim adamı tarafından yeterince kullanılmamaktadır, özellikle akademik araştırma topluluğunda ve kullanım eksiklikleri bilimsel çıktının kalitesini olumsuz yönde etkilemektedir.
CRP-XL, trombosit alanının 1995’teki tanımından bu yana onlarca yıldır kullandığı spesifik bir GPVI’ya özgü agonisttir2 ve topluluğun GPVI’nın rolünü 3,4’ten beri diğer kollajen bağlayıcı trombosit proteinlerinden ayırmasına yardımcı olur. Bu agonist, çeşitli ticari kaynaklardan temin edilebilir veya şirket içinde üretilebilir. Peptit monomeri bir tedarikçiden satın alınabilir ve daha sonra şirket içinde çapraz bağlanabilir veya bu, tedarikçi tarafından ekstra bir ücret karşılığında yapılabilir. Teslimat sırasında gerekli saflığın azaltılmasıyla daha fazla maliyet tasarrufu sağlanabilir (örneğin, %70’e karşı %95). CRP-XL’in nasıl saklanması gerektiği konusunda da bir fikir birliği yoktur, bazıları kriyodepolamayı ve diğerleri soğutmayı tercih eder, bazıları malzemeyi kullanıma kadar liyofilize tutar ve diğerleri onu çözelti içinde saklar (tercihe bağlı olarak su veya tampon). Bu nedenle, laboratuvar stoklarının kalitesi ve bileşimi standartlaştırılmamış veya uyumlaştırılmamıştır. Bu agonist, aktivite birimlerinden ziyade tanımlanmış bir konsantrasyonda (kütle / hacim) kullanıldığından, CRP-XL’nin bir laboratuvarda, örneğin 1 μg / mL’de gücü diğeriyle aynı olmayacaktır. Sahada kullanılan diğer trombosit agonistlerinin zaten standardize edildiğini belirtmekte fayda var (örneğin, kütle / hacimden ziyade aktivite birimlerinde sağlanan ve kullanılan trombin), bu nedenle kütle / hacimden biyolojik birimlere doğru hareket toplum için çok zor olmamalıdır. Ayrıca, CRP-XL de dahil olmak üzere trombosit agonistlerine hasta yanıtlarının, agonistlere duyarlılıkları ve yanıt verme kapasiteleri (yanıt derecesi) açısından değişken olduğu belirtilmelidir5, bu nedenle testlerde tutarlı miktarlarda agonist aktivitesi kullanmak daha da önemlidir.
Trombosit agonistleri, ağırlık/hacim yerine tanımlanmış bir aktivitede kullanılarak uyumlu hale getirilebilirse, bir laboratuvardaki bir deneyin diğer laboratuvarlardakiyle doğrudan karşılaştırılabilir olması ve güvenle doğru bir şekilde çoğaltılabilmesi sağlanabilir. Saha, CRP-XL aktivitesinin nasıl depolanacağı ve standartlaştırılacağı konusunda bir anlaşmaya varana kadar, kullanıldığı aylar/yıllar boyunca tutarlılığını sağlamak için malzeme üzerinde düzenli kontroller yapmak esastır.
Biyolojik standartlar için aktivite değeri ataması, işbirliğine dayalı, çok merkezli çalışmalar yoluyla yapılmalıdır (örneğin 6,7) ve uzmanlık gerektirir. Trombosit agonistleri için yerleşik biyolojik standartlara duyulan ihtiyaç, yakın zamanda Uluslararası Tromboz ve Hemostaz Derneği (ISTH) tarafından desteklenen ortak bir çok merkezli çalışma8 ile vurgulanmıştır; Uluslararası bir CRP-XL standardı mevcut olana kadar, araştırmacılar zaman içinde tutarlılığı sağlamak için kendi materyallerini yerel olarak standartlaştırabilirler ve ticari olarak veya kurum içinde tedarik edilen yeni materyal, önceki hazırlıklarla ve topluluğun geri kalanıyla karşılaştırılabilir bir aktiviteye sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada gösterildiği gibi, malzemeleri standartlaştırma süreci çok basittir. Yeni malzeme partilerini değerlendirmek ve/veya mevcut partinin stabil olup olmadığını ve zaman içinde aktivite kaybetmediğini kontrol etmek biraz zaman gerektirse de, ödül, deneylerin tekrar tekrar tekrarlanabilir olması ve sadece bir reaktif partisinin ömründen ziyade yıllar içinde karşılaştırılabilir olmasıdır. Aynı zamanda, diğer araştırmacıların tahlil koşullarını doğru bir şekilde yeniden oluşturabileceği ve topluluğun küresel düzeyde uyumlu hale getirildiği anlamına gelir. Protokoldeki kritik adımlar, tam kan alma ve PRP preparatı9’un yanı sıra seyreltme serisini yaparken hassasiyeti içerir. EC50 karşılaştırmasına geçmeden önce test ve standart eğrilerin paralel olduğundan emin olmak da önemlidir. Çizgiler paralel değilse veya asimptotlar eşdeğer değilse, test ve standart malzemenin bir dereceye kadar farklı olduğunu gösterebilir.
Biyolojik bilimlerde çalışan herkes, biyolojik tahlillerin her zaman tutarlı bir şekilde çalışmadığını bilir, bu nedenle verileri değerlendirirken buna dikkat etmek gerekir. Burada gösterilen örnekte, aynı olmasa da çok benzer iki malzemenin gücünü ölçmek için aynı donörleri kullanıyor olsak da, tepe yamaçları ve asimptotlar aynı değildir. Yine de bir dereceye kadar değişkenliği kabul ediyoruz ve eğrilerin bu durumda paralel olduğu ve bu nedenle potansiyeli karşılaştırmak ve ayarlamak için uygun olduğu sonucuna varıyoruz. Biyolojik moleküller büyük ve karmaşıktır ve üretim sırasındaki translasyon sonrası modifikasyonlar, biyo-tahlillerdeki güçlerini etkileyebilir. Biyomoleküllerin ve biyoanalizlerin standartlaştırılması sadece kütle veya hacim kullanılarak yapılamaz ve bir biyo-tahlildeki biyolojik aktivitenin ölçülmesi ve karşılaştırılması ile yapılmalıdır11. Kişi, verileri tahlil bağlamında değerlendirmek için eğitimini ve deneyimini kullanmalıdır.
Tekniğin sınırlamaları, veriler reaktif(ler)le ilgili bir soruna işaret etse de, sorunun ne olduğunu size söyleyememesidir. Malzemelerin neden karşılaştırılabilir olmadığını belirlemek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulacaktır. İdeal bir dünyada, deney(ler) ve müteakip bilimsel sonuçlar için kritik olan herhangi bir materyal kütle spektroskopisi ile doğrulanacaktır, ancak bu her zaman bir seçenek değildir. Bununla birlikte, veriler karşılaştırılabilir değilse, yine de bir miktar kapasitede daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir. Bu yaklaşımın bir diğer sınırlaması, bunu yapmak için gereken zaman ve kaynaklardır. İdeal olarak, materyale biyolojik aktivite atama konusunda bir miktar güven sağlamak için test ve standart 3-6 donörde karşılaştırılmalıdır, ancak bunun tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği destekleyerek haklı olduğunu düşünüyoruz. Deneyler her yapıldığında biyolojik materyalin standartlaştırılmasına gerek yoktur, ancak en azından, stabilite ve kullanıma bağlı olarak her yeni agonist grubu için, tercihen daha sık yapılmalıdır. Gerçekten de, bir standart kullanıma sunulursa, bu, uluslararası standardizasyon kuruluşlarının netlik sağlayabileceği bir şeydir.
Burada gösterilen örnek, trombosit agregasyonunun ölçülmesi bağlamında CRP-XL için olsa da, biyo-tahlillerde biyomoleküllerin biyolojik aktivitesini karşılaştırma protokolü sektör genelinde yaygın olarak uygulanabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiç kimse.
Materials
| 4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
| 4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
| Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Prism | Graphpad | Analysis software package | |
| Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |
References
- Faya, P., et al. Potency assignment of biotherapeutic reference standards. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113577 (2020).
- Morton, L. F., et al. Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity. The Biochemical Journal. 306 (2), 337-344 (1995).
- Pugh, N., et al. Synergism between platelet collagen receptors defined using receptor-specific collagen-mimetic peptide substrata in flowing blood. Blood. 115 (24), 5069-5079 (2010).
- Farndale, R. W., et al. Cell-collagen interactions: the use of peptide Toolkits to investigate collagen-receptor interactions. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 2), 241-250 (2008).
- Dunster, J. L., et al. Multiparameter phenotyping of platelet reactivity for stratification of human cohorts. Blood Advances. 5 (20), 4017-4030 (2021).
- Hubbard, A. R., et al. Establishment of the WHO 2nd International Standard Factor V, plasma (16/374): communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 695-697 (2019).
- Sergaki, C., et al. Developing whole cell standards for the microbiome field. Microbiome. 10 (1), 123 (2022).
- Alessi, M. C., et al. Multi-center evaluation of light transmission platelet aggregation reagents: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. (23), (2023).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , (2013).
- Taylor, L., et al. Discovery of novel GPVI receptor antagonists by structure-based repurposing. PLoS One. 9 (6), e101209 (2014).
- Coxon, C. H., Longstaff, C., Burns, C. Applying the science of measurement to biology: Why bother. PLoS Biology. 17 (6), e3000338 (2019).
