Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak
Summary
Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.
Abstract
Merkezi sinir sistemi (CNS) modelleri, in vivo olarak bulunan birbirine bağlı hücrelerin karmaşık ağını özetlemelidir.CNS öncelikle nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve mikroglia’dan oluşur. Hayvan kullanımını değiştirme ve azaltma çabalarının artması nedeniyle, CNS enfeksiyonları ve patolojileri için terapötiklerin geliştirilmesine izin veren doğuştan gelen hücre özelliklerini keşfetmek için çeşitli in vitro hücre kültürü sistemleri geliştirilmiştir. Bazı araştırma soruları, (indüklenmiş) pluripotent kök hücreler gibi insan temelli hücre kültürü sistemleri tarafından ele alınabilirken, insan hücreleriyle çalışmanın kullanılabilirlik, maliyetler ve etik açısından kendi sınırlamaları vardır. Burada, embriyonik fare beyinlerinden hücreleri izole etmek ve kültürlemek için benzersiz bir protokol açıklıyoruz. Ortaya çıkan karışık nöral hücre kültürleri, beyinde in vivo olarak bulunan çeşitli hücre popülasyonlarını ve etkileşimlerini taklit eder. Mevcut eşdeğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol beynin özelliklerini daha yakından taklit eder ve ayrıca daha fazla hücre toplar, böylece hamile bir fareden daha fazla deneysel koşulun araştırılmasına izin verir. Ayrıca, protokol nispeten kolay ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Bu kültürler, 96 kuyucuklu yüksek verimli ekranlar, 24 kuyucuklu mikroskopi analizi ve akış sitometrisi ve ters transkripsiyon-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi için 6 kuyucuklu kültürler dahil olmak üzere çeşitli ölçeklerde kullanım için optimize edilmiştir. Bu kültür yöntemi, in vitro yöntemlerin rahatlığı ile CNS’nin bazı karmaşıklıkları bağlamında enfeksiyon ve bağışıklığı araştırmak için güçlü bir araçtır.
Introduction
Merkezi sinir sistemi (CNS) hakkındaki anlayışımızı geliştirmek, birçok nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalık için terapötik seçenekleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Beyin, omurilik ve optik sinirler içindeki birbirine bağlı hücrelerin karmaşık bir ağı olan CNS, nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve bunların doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olan mikroglia1’i içerir. İn vitro bir yaklaşım genellikle anlamlı araştırmalar yapmak için gereken fare sayısını önemli ölçüde azaltabilir; Bununla birlikte, CNS’nin karmaşık doğası, hücre hatlarını kullanarak in vivo durumu özetlemeyi imkansız kılar. Karışık nöral hücre kültürleri, Replasman, İndirgeme ve İyileştirme (3R) ilkeleri 2,3 doğrultusunda, ilgili bir modelde nöro(immüno)loji sorularını araştırmak için son derece değerli bir araştırma aracı sağlar.
Thomson ve ark., yukarıda belirtilen tüm ana CNShücre tiplerine farklılaşan prenatal omurilik hücrelerini kullanarak bir hücre kültürü yöntemi tanımlamıştır. Bu sistem ayrıca sinaps oluşumuna, miyelinli aksonlara ve Ranvier düğümlerine sahiptir. Bu kültürleme yönteminin temel sınırlaması, omurilik olarak, beyni yararlı bir şekilde modellememesi ve embriyonik gün 13 (E13) omuriliklerinden elde edilen hücre veriminin daralmasıdır. Bu nedenle, bu, araştırılabilecek deneysel koşulların sayısını sınırlar. Bu nedenle, bu çalışma, hayvanlara olan gereksinimleri azaltmak için artan hücre verimi ile beynin özelliklerini özetleyen yeni bir hücre kültürü sistemi geliştirmeyi amaçlamıştır.
Thomson ve ark.’yı başlangıç noktası olarak kullanarak, tamamen doğum öncesi fare beyinlerinden türetilmiş bir hücre kültürü modeli geliştirdik. Bu kültürler, omurilik kültürleriyle aynı hücre popülasyonlarına, birbirine bağlanabilirliğe ve tedavi seçeneklerine sahiptir, ancak karşılaştırıldığında daha az miyelinasyon vardır. Bununla birlikte, yaklaşık üç kat daha yüksek hücre verimine sahip bir CNS in vitro modeline sahip olmak daha verimlidir ve daha az fare ve daha az zaman işleme embriyosu gerektirir. Bu benzersiz kültür sistemini, mikroskopi analizi için cam kapak fişleri ve yüksek verimli araştırmalar için 96 delikli plakalar da dahil olmak üzere çeşitli boyutlarda plastik kuyu plakaları kullanmak da dahil olmak üzere birden fazla aşağı akış uygulaması ve terazisi için optimize ettik.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNS, beyinden omuriliğe kadar uzanan karmaşık bir ağdır ve ağırlıklı olarak nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve mikroglia1 olmak üzere birçok hücre tipinden oluşur. Her hücrenin homeostazı korumada ve CNS 9,10,11’deki zorluklara uygun yanıtlar üretmede önemli bir rolü olduğundan, tüm bu hücre tiplerini içeren bir kültür sistemi, beynin bir uyarana nasıl tepki verebilece?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Edgar ve Linington laboratuvarlarının üyelerine, özellikle Prof. Chris Linington, Dr. Diana Arseni ve Dr. Katja Muecklisch’e, tavsiyeleri, yararlı yorumları ve bu kültürleri kurarken kültürleri beslemedeki yardımları için teşekkür ederiz. Hücre Profilcisi boru hatları için başlangıç noktaları sağladığı için Dr. Muecklisch’e özellikle teşekkür ederiz. Bu çalışma MS Derneği (hibe 122) ve Yuri ve Lorna Chernajovsky vakfı tarafından MP’ye desteklendi; Glasgow Üniversitesi’nin JC ve MP’ye fon sağlaması; ve Wellcome Trust (217093 / Z / 19 / Z) ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MRV0109721) GJG’ye.
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).
