Établissement de cultures de cellules neuronales et gliales mixtes à partir de cerveaux de souris embryonnaires pour étudier l’infection et l’immunité innée
Summary
Ce protocole présente une façon unique de générer des cultures cellulaires du système nerveux central à partir de cerveaux de souris embryonnaires du jour 17 pour la recherche en neuro(immuno)logie. Ce modèle peut être analysé à l’aide de diverses techniques expérimentales, notamment la RT-qPCR, la microscopie, l’ELISA et la cytométrie en flux.
Abstract
Les modèles du système nerveux central (SNC) doivent récapituler le réseau complexe de cellules interconnectées trouvé in vivo. Le SNC se compose principalement de neurones, d’astrocytes, d’oligodendrocytes et de microglies. En raison des efforts croissants pour remplacer et réduire l’utilisation animale, une variété de systèmes de culture cellulaire in vitro ont été développés pour explorer les propriétés cellulaires innées, ce qui permet le développement de thérapies pour les infections et les pathologies du SNC. Alors que certaines questions de recherche peuvent être abordées par des systèmes de culture cellulaire basés sur l’homme, tels que les cellules souches pluripotentes (induites), travailler avec des cellules humaines a ses propres limites en ce qui concerne la disponibilité, les coûts et l’éthique. Ici, nous décrivons un protocole unique pour isoler et cultiver des cellules à partir de cerveaux de souris embryonnaires. Les cultures de cellules neurales mixtes qui en résultent imitent plusieurs populations cellulaires et interactions trouvées dans le cerveau in vivo. Par rapport aux méthodes équivalentes actuelles, ce protocole imite plus étroitement les caractéristiques du cerveau et recueille également plus de cellules, permettant ainsi d’étudier plus de conditions expérimentales à partir d’une souris gravide. De plus, le protocole est relativement facile et hautement reproductible. Ces cultures ont été optimisées pour une utilisation à différentes échelles, y compris des cribles à haut débit à 96 puits, des analyses de microscopie à 24 puits et des cultures à 6 puits pour la cytométrie en flux et l’analyse de la réaction en chaîne de la polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR). Cette méthode de culture est un outil puissant pour étudier l’infection et l’immunité dans le contexte d’une partie de la complexité du SNC avec la commodité des méthodes in vitro .
Introduction
Il est essentiel d’améliorer notre compréhension du système nerveux central (SNC) pour améliorer les options thérapeutiques pour de nombreuses maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives. Le SNC, un réseau complexe de cellules interconnectées dans le cerveau, la moelle épinière et les nerfs optiques, comprend des neurones, des oligodendrocytes, des astrocytes et leurs cellules immunitaires innées, la microglie1. Une approche in vitro peut souvent réduire considérablement le nombre de souris nécessaires pour effectuer des recherches significatives; Cependant, la nature complexe du SNC rend impossible la récapitulation de la situation in vivo à l’aide de lignées cellulaires. Les cultures de cellules neurales mixtes constituent un outil de recherche extrêmement précieux pour étudier les questions de neuro(immuno)logie dans un modèle pertinent, conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R) 2,3.
Thomson et al. ont décrit une méthode de culture cellulaire utilisant des cellules prénatales de la moelle épinière qui se différencient en tous les principaux types de cellules du SNCsusmentionnés 4. Ce système a également la formation de synapses, les axones myélinisés et les nœuds de Ranvier. La principale limitation de cette méthode de culture est que, étant la moelle épinière, elle ne modélise pas utilement le cerveau, et les rendements cellulaires du jour embryonnaire 13 (E13) de la moelle épinière se contractent. Ainsi, cela limite le nombre de conditions expérimentales qui peuvent être étudiées. Par conséquent, cette étude visait à développer un nouveau système de culture cellulaire qui récapitule les caractéristiques du cerveau avec un rendement cellulaire accru pour réduire les besoins des animaux.
En utilisant Thomson et al. comme point de départ, nous avons développé un modèle de culture cellulaire dérivé uniquement de cerveaux de souris prénatals. Ces cultures ont les mêmes populations cellulaires, l’interconnectivité et les mêmes options de traitement que les cultures de la moelle épinière, sauf qu’il y a moins de myélinisation en comparaison. Cependant, avoir un modèle in vitro du SNC avec un rendement cellulaire environ trois fois plus élevé est plus efficace, nécessitant moins de souris et moins de temps de traitement des embryons. Nous avons optimisé ce système de culture unique pour de multiples applications et échelles en aval, y compris l’utilisation de lamelles de couverture en verre pour l’analyse microscopique et de différentes tailles de plaques de puits en plastique, y compris des plaques de 96 puits pour la recherche à haut débit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le SNC est un réseau complexe qui s’étend du cerveau à la moelle épinière et se compose de nombreux types de cellules, principalement des neurones, des oligodendrocytes, des astrocytes et des microglies1. Comme chaque cellule a un rôle important dans le maintien de l’homéostasie et la génération de réponses appropriées aux défis du SNC 9,10,11, un système de culture qui contient tous ces types de cellules est u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres des laboratoires Edgar et Linington, en particulier le professeur Chris Linington, le Dr Diana Arseni et le Dr Katja Muecklisch, pour leurs conseils, leurs commentaires utiles et leur aide pour nourrir les cultures pendant que nous mettons en place ces cultures. Nous remercions tout particulièrement le Dr Muecklisch d’avoir fourni les points de départ des pipelines Cell Profiler. Ce travail a été soutenu par la Société de la SP (subvention 122) et la Fondation Yuri et Lorna Chernajovsky à MP; Financement de l’Université de Glasgow à JC et MP; et Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) et Medical Research Council (MRV0109721) à GJG.
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
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