Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen
Summary
Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.
Abstract
Modellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) moeten het complexe netwerk van onderling verbonden cellen in vivo samenvatten.Het CZS bestaat voornamelijk uit neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en microglia. Vanwege de toenemende inspanningen om het gebruik van dieren te vervangen en te verminderen, zijn er verschillende in vitro celkweeksystemen ontwikkeld om aangeboren celeigenschappen te onderzoeken, die de ontwikkeling van therapieën voor CZS-infecties en pathologieën mogelijk maken. Hoewel bepaalde onderzoeksvragen kunnen worden aangepakt door op mensen gebaseerde celkweeksystemen, zoals (geïnduceerde) pluripotente stamcellen, heeft het werken met menselijke cellen zijn eigen beperkingen met betrekking tot beschikbaarheid, kosten en ethiek. Hier beschrijven we een uniek protocol voor het isoleren en kweken van cellen uit embryonale muizenhersenen. De resulterende gemengde neurale celculturen bootsen verschillende celpopulaties en interacties na die in vivo in de hersenen worden aangetroffen. In vergelijking met de huidige equivalente methoden bootst dit protocol de kenmerken van de hersenen beter na en verzamelt het ook meer cellen, waardoor meer experimentele omstandigheden van één zwangere muis kunnen worden onderzocht. Verder is het protocol relatief eenvoudig en zeer reproduceerbaar. Deze culturen zijn geoptimaliseerd voor gebruik op verschillende schalen, waaronder 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analyse en 6-well culturen voor flow cytometrie en reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analyse. Deze kweekmethode is een krachtig hulpmiddel om infectie en immuniteit te onderzoeken binnen de context van een deel van de complexiteit van het CZS met het gemak van in vitro methoden.
Introduction
Het verbeteren van ons begrip van het centrale zenuwstelsel (CZS) is van cruciaal belang om de therapeutische opties voor veel neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten te verbeteren. Het CZS, een complex netwerk van onderling verbonden cellen in de hersenen, het ruggenmerg en de oogzenuwen, bestaat uit neuronen, oligodendrocyten, astrocyten en hun aangeboren immuuncellen, de microglia1. Een in vitro aanpak kan vaak het aantal muizen dat nodig is om zinvol onderzoek uit te voeren drastisch verminderen; de complexe aard van het CZS maakt het echter onmogelijk om de in vivo situatie samen te vatten met behulp van cellijnen. Gemengde neurale celculturen bieden een uiterst waardevol onderzoeksinstrument om neuro(immuno)logie vragen te onderzoeken in een relevant model, in lijn met de Replacement, Reduction and Refinement (3Rs) principes 2,3.
Thomson et al. beschreven een celkweekmethode met behulp van prenatale ruggenmergcellen die differentiëren in alle bovengenoemde hoofdtypen van CZS-cellen4. Dit systeem heeft ook synapsvorming, gemyeliniseerde axonen en knooppunten van Ranvier. De belangrijkste beperking van deze kweekmethode is dat het, omdat het ruggenmerg is, de hersenen niet nuttig modelleert en dat de celopbrengsten van embryonale dag 13 (E13) ruggenmerg vernauwen. Dit beperkt dus het aantal experimentele omstandigheden dat kan worden onderzocht. Daarom was deze studie gericht op het ontwikkelen van een nieuw celkweeksysteem dat de kenmerken van de hersenen samenvat met een verhoogde celopbrengst om de vereisten voor dieren te verminderen.
Met Thomson et al. als uitgangspunt ontwikkelden we een celkweekmodel dat puur was afgeleid van prenatale muizenhersenen. Deze culturen hebben dezelfde celpopulaties, interconnectiviteit en behandelingsopties als de ruggenmergculturen, behalve dat er in vergelijking minder myelinisatie is. Het hebben van een CZS in vitro model met een ongeveer drie keer hogere celopbrengst is echter efficiënter, waardoor minder muizen en minder tijd nodig zijn om embryo’s te verwerken. We hebben dit unieke kweeksysteem geoptimaliseerd voor meerdere downstream-toepassingen en weegschalen, waaronder het gebruik van glazen afdekplaten voor microscopie-analyse en verschillende maten plastic putplaten, waaronder 96-putplaten voor onderzoek met hoge doorvoer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het CZS is een complex netwerk dat zich uitstrekt van de hersenen tot aan het ruggenmerg en bestaat uit vele celtypen, voornamelijk neuronen, oligodendrocyten, astrocyten en microglia1. Omdat elke cel een belangrijke rol speelt bij het handhaven van homeostase en het genereren van passende reacties op uitdagingen in het CZS 9,10,11, is een kweeksysteem dat al deze celtypen bevat een nuttig en veelzijdig hulpmiddel om te onderzo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag de leden van de Edgar- en Linington-laboratoria bedanken, in het bijzonder prof. Chris Linington, dr. Diana Arseni en dr. Katja Muecklisch, voor hun advies, nuttige opmerkingen en hulp bij het voeden van de culturen terwijl we deze culturen opzetten. Speciale dank gaat uit naar Dr. Muecklisch voor het leveren van de uitgangspunten voor de Cell Profiler-pijplijnen. Dit werk werd ondersteund door de MS Society (subsidie 122) en de Yuri en Lorna Chernajovsky stichting aan MP; Financiering van de Universiteit van Glasgow aan JC en MP; en Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) en Medical Research Council (MRV0109721) aan GJG.
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412 (2015).
