Stabilire colture cellulari miste neuronali e gliali da cervelli di topo embrionali per studiare l'infezione e l'immunità innata
Summary
Questo protocollo presenta un modo unico di generare colture cellulari del sistema nervoso centrale da cervelli di topo embrionali del giorno 17 per la ricerca neuro(immuno)logica. Questo modello può essere analizzato utilizzando varie tecniche sperimentali, tra cui RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria a flusso.
Abstract
I modelli del sistema nervoso centrale (SNC) devono ricapitolare la complessa rete di cellule interconnesse trovate in vivo. Il SNC è costituito principalmente da neuroni, astrociti, oligodendrociti e microglia. A causa dei crescenti sforzi per sostituire e ridurre l’uso di animali, sono stati sviluppati una varietà di sistemi di coltura cellulare in vitro per esplorare le proprietà cellulari innate, che consentono lo sviluppo di terapie per infezioni e patologie del SNC. Mentre alcune domande di ricerca possono essere affrontate da sistemi di coltura cellulare basati sull’uomo, come le cellule staminali pluripotenti (indotte), lavorare con cellule umane ha i suoi limiti per quanto riguarda la disponibilità, i costi e l’etica. Qui, descriviamo un protocollo unico per isolare e coltivare cellule da cervelli di topo embrionali. Le colture di cellule neurali miste risultanti imitano diverse popolazioni cellulari e interazioni trovate nel cervello in vivo. Rispetto agli attuali metodi equivalenti, questo protocollo imita più da vicino le caratteristiche del cervello e raccoglie anche più cellule, consentendo così di studiare più condizioni sperimentali da un topo gravido. Inoltre, il protocollo è relativamente facile e altamente riproducibile. Queste colture sono state ottimizzate per l’uso su varie scale, tra cui schermi ad alta produttività basati su 96 pozzetti, analisi al microscopio a 24 pozzetti e colture a 6 pozzetti per la citometria a flusso e l’analisi della reazione a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa (RT-qPCR). Questo metodo di coltura è un potente strumento per studiare l’infezione e l’immunità nel contesto di alcune delle complessità del SNC con la comodità dei metodi in vitro .
Introduction
Migliorare la nostra comprensione del sistema nervoso centrale (SNC) è fondamentale per migliorare le opzioni terapeutiche per molte malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative. Il SNC, una complessa rete di cellule interconnesse all’interno del cervello, del midollo spinale e dei nervi ottici, comprende neuroni, oligodendrociti, astrociti e le loro cellule immunitarie innate, la microglia1. Un approccio in vitro può spesso ridurre drasticamente il numero di topi necessari per eseguire ricerche significative; tuttavia, la natura complessa del SNC rende impossibile ricapitolare la situazione in vivo utilizzando linee cellulari. Le colture miste di cellule neurali forniscono uno strumento di ricerca estremamente prezioso per indagare le questioni neuro(immuno)logiche in un modello pertinente, in linea con i principi di sostituzione, riduzione e raffinamento (3R) 2,3.
Thomson et al. hanno descritto un metodo di coltura cellulare utilizzando cellule del midollo spinale prenatale che si differenziano in tutti i suddetti principali tipi di cellule del SNC4. Questo sistema ha anche formazione di sinapsi, assoni mielinizzati e nodi di Ranvier. Il limite principale di questo metodo di coltura è che, essendo il midollo spinale, non modella utilmente il cervello, e le rese cellulari dal giorno embrionale 13 (E13) del midollo spinale sono costrittive. Pertanto, questo limita il numero di condizioni sperimentali che possono essere studiate. Pertanto, questo studio mirava a sviluppare un nuovo sistema di coltura cellulare che ricapitola le caratteristiche del cervello con una maggiore resa cellulare per ridurre i requisiti per gli animali.
Usando Thomson et al. come punto di partenza, abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare derivato esclusivamente dal cervello prenatale del topo. Queste colture hanno le stesse popolazioni cellulari, interconnettività e opzioni di trattamento delle colture del midollo spinale, tranne che c’è meno mielinizzazione in confronto. Tuttavia, avere un modello in vitro sul SNC con una resa cellulare circa tre volte superiore è più efficiente, richiedendo meno topi e meno tempo per elaborare gli embrioni. Abbiamo ottimizzato questo esclusivo sistema di coltura per molteplici applicazioni e bilance a valle, incluso l’utilizzo di vetrini di copertura per l’analisi al microscopio e varie dimensioni di lastre di plastica, comprese le lastre a 96 pozzetti per la ricerca ad alta produttività.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il SNC è una rete complessa che si estende dal cervello fino al midollo spinale e consiste di molti tipi di cellule, prevalentemente neuroni, oligodendrociti, astrociti e microglia1. Poiché ogni cellula ha un ruolo importante nel mantenere l’omeostasi e generare risposte appropriate alle sfide nel SNC 9,10,11, un sistema di coltura che contiene tutti questi tipi di cellule è uno strumento utile e versatile per studiare come …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i membri dei laboratori Edgar e Linington, in particolare il Prof. Chris Linington, la Dott.ssa Diana Arseni e la Dott.ssa Katja Muecklisch, per i loro consigli, commenti utili e assistenza nell’alimentazione delle culture mentre creiamo queste culture. Un ringraziamento particolare va al Dr. Muecklisch per aver fornito i punti di partenza per le pipeline di Cell Profiler. Questo lavoro è stato sostenuto dalla MS Society (sovvenzione 122) e dalla fondazione Yuri e Lorna Chernajovsky a MP; Finanziamenti dell’Università di Glasgow a JC e MP; e Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) e Medical Research Council (MRV0109721) a GJG.
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
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