Estabelecendo culturas mistas de células neuronais e gliais de cérebros embrionários de camundongos para estudar infecção e imunidade inata
Summary
Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.
Abstract
Modelos do sistema nervoso central (SNC) devem recapitular a complexa rede de células interconectadas encontradas in vivo. O SNC consiste principalmente de neurônios, astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Devido aos crescentes esforços para substituir e reduzir o uso animal, uma variedade de sistemas de cultura de células in vitro tem sido desenvolvida para explorar propriedades celulares inatas, que permitem o desenvolvimento de terapêuticas para infecções e patologias do SNC. Embora certas questões de pesquisa possam ser abordadas por sistemas de cultura de células baseados em humanos, como células-tronco pluripotentes (induzidas), trabalhar com células humanas tem suas próprias limitações em relação à disponibilidade, custos e ética. Aqui, descrevemos um protocolo único para isolar e cultivar células de cérebros embrionários de camundongos. As culturas de células neurais mistas resultantes imitam várias populações de células e interações encontradas no cérebro in vivo. Em comparação com os métodos equivalentes atuais, este protocolo imita mais de perto as características do cérebro e também ganha mais células, permitindo assim que mais condições experimentais sejam investigadas a partir de uma rata grávida. Além disso, o protocolo é relativamente fácil e altamente reprodutível. Essas culturas foram otimizadas para uso em várias escalas, incluindo telas de alto rendimento baseadas em 96 poços, análise de microscopia de 24 poços e culturas de 6 poços para citometria de fluxo e análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR). Este método de cultura é uma ferramenta poderosa para investigar infecção e imunidade dentro do contexto de alguma complexidade do SNC com a conveniência de métodos in vitro .
Introduction
Melhorar nossa compreensão do sistema nervoso central (SNC) é fundamental para melhorar as opções terapêuticas para muitas doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas. O SNC, uma rede complexa de células interconectadas dentro do cérebro, medula espinhal e nervos ópticos, compreende neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e suas células imunes inatas, a microglia1. Uma abordagem in vitro pode muitas vezes reduzir drasticamente o número de camundongos necessários para realizar pesquisas significativas; no entanto, a natureza complexa do SNC torna impossível recapitular a situação in vivo usando linhagens celulares. Culturas mistas de células neurais fornecem uma ferramenta de pesquisa extremamente valiosa para investigar questões de neuro(imuno)logia em um modelo relevante, de acordo com os princípios de Substituição, Redução e Refinamento (3Rs)2,3.
Thomson e col. descreveram um método de cultura celular utilizando células pré-natais da medula espinhal que se diferenciam em todos os principais tipos celulares do SNC jámencionados4. Este sistema também tem formação de sinapses, axônios mielinizados e nós de Ranvier. A principal limitação deste método de cultura é que, sendo a medula espinhal, ele não modela utilmente o cérebro, e os rendimentos celulares a partir do 13º dia embrionário (E13) medulares são constritores. Assim, isso limita o número de condições experimentais que podem ser investigadas. Portanto, este estudo teve como objetivo desenvolver um novo sistema de cultura celular que recapitule as características do cérebro com aumento do rendimento celular para reduzir as exigências para animais.
Usando Thomson et al., como ponto de partida, desenvolvemos um modelo de cultura celular derivado puramente de cérebros pré-natais de camundongos. Essas culturas têm as mesmas populações celulares, interconectividade e opções de tratamento que as culturas da medula espinhal, exceto que há menos mielinização em comparação. No entanto, ter um modelo in vitro do SNC com um rendimento celular aproximadamente três vezes maior é mais eficiente, exigindo menos camundongos e menos tempo de processamento de embriões. Otimizamos este sistema de cultura exclusivo para várias aplicações e escalas downstream, incluindo o uso de lamínulas de vidro para análise de microscopia e vários tamanhos de placas de poço plástico, incluindo placas de 96 poços para pesquisa de alto rendimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
O SNC é uma rede complexa que se estende do cérebro até a medula espinhal e consiste de vários tipos celulares, predominantemente neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e microglia1. Como cada célula tem um papel importante na manutenção da homeostase e na geração de respostas adequadas aos desafios no SNC 9,10,11, um sistema de cultura que contenha todos esses tipos celulares é uma ferramenta útil e versátil pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos membros dos laboratórios Edgar e Linington, particularmente ao Prof. Chris Linington, à Dra. Diana Arseni e à Dra. Katja Muecklisch, por seus conselhos, comentários úteis e assistência com a alimentação das culturas enquanto criamos essas culturas. Um agradecimento especial ao Dr. Muecklisch por fornecer os pontos de partida para os pipelines do Cell Profiler. Este trabalho foi apoiado pela Sociedade MS (bolsa 122) e pela fundação Yuri e Lorna Chernajovsky para MP; Financiamento da Universidade de Glasgow para JC e MP; e Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) e Medical Research Council (MRV0109721) para GJG.
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
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