Summary

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, Zellkulturen des Zentralnervensystems aus embryonalen Tag-17-Mäusegehirnen für die neuro(immun)ologische Forschung zu generieren. Dieses Modell kann mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden, darunter RT-qPCR, Mikroskopie, ELISA und Durchflusszytometrie.

Abstract

Modelle des Zentralnervensystems (ZNS) müssen das komplexe Netzwerk miteinander verbundener Zellen rekapitulieren, das in vivo zu finden ist.Das ZNS besteht hauptsächlich aus Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia. Aufgrund der zunehmenden Bemühungen, den Einsatz von Tieren zu ersetzen und zu reduzieren, wurde eine Vielzahl von In-vitro-Zellkultursystemen entwickelt, um die Eigenschaften angeborener Zellen zu erforschen, die die Entwicklung von Therapeutika für ZNS-Infektionen und -Pathologien ermöglichen. Während bestimmte Forschungsfragen mit humanen Zellkultursystemen beantwortet werden können, wie z. B. (induzierte) pluripotente Stammzellen, hat die Arbeit mit menschlichen Zellen ihre eigenen Grenzen in Bezug auf Verfügbarkeit, Kosten und Ethik. Hier beschreiben wir ein einzigartiges Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus embryonalen Mäusegehirnen. Die daraus resultierenden gemischten neuronalen Zellkulturen ahmen mehrere Zellpopulationen und Interaktionen nach, die im Gehirn in vivo zu finden sind. Im Vergleich zu aktuellen äquivalenten Methoden ahmt dieses Protokoll die Eigenschaften des Gehirns genauer nach und sammelt auch mehr Zellen, so dass mehr experimentelle Bedingungen an einer trächtigen Maus untersucht werden können. Darüber hinaus ist das Protokoll relativ einfach und sehr gut reproduzierbar. Diese Kulturen wurden für den Einsatz in verschiedenen Maßstäben optimiert, darunter 96-Well-basierte Hochdurchsatz-Screens, 24-Well-Mikroskopieanalysen und 6-Well-Kulturen für die Durchflusszytometrie und die Analyse der reversen Transkriptions-quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Diese Kulturmethode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Infektionen und Immunität im Zusammenhang mit einem Teil der Komplexität des ZNS mit der Bequemlichkeit von In-vitro-Methoden zu untersuchen.

Introduction

Die Verbesserung unseres Verständnisses des zentralen Nervensystems (ZNS) ist entscheidend, um die therapeutischen Optionen für viele neuroinflammatorische und neurodegenerative Erkrankungen zu verbessern. Das ZNS, ein komplexes Netzwerk miteinander verbundener Zellen im Gehirn, Rückenmark und Sehnerven, besteht aus Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und ihren angeborenen Immunzellen, den Mikroglia1. Ein In-vitro-Ansatz kann die Anzahl der Mäuse, die für sinnvolle Forschung erforderlich sind, oft drastisch reduzieren. Die Komplexität des ZNS macht es jedoch unmöglich, die In-vivo-Situation mit Hilfe von Zelllinien zu rekapitulieren. Gemischte neuronale Zellkulturen stellen ein äußerst wertvolles Forschungswerkzeug dar, um neuro(immun)ologische Fragestellungen in einem relevanten Modell zu untersuchen, in Übereinstimmung mit den Prinzipien von Replacement, Reduction and Refinement (3R) 2,3.

Thomson et al. beschrieben eine Zellkulturmethode mit pränatalen Rückenmarkszellen, die sich in alle oben genannten Hauptzelltypen des ZNS differenzieren4. In diesem System gibt es auch Synapsenbildung, myelinisierte Axone und Ranvier-Knoten. Die Haupteinschränkung dieser Kultivierungsmethode besteht darin, dass das Rückenmark das Gehirn nicht sinnvoll modelliert und die Zellerträge ab dem 13. Embryotag (E13) das Rückenmark verengt. Dies schränkt die Anzahl der experimentellen Bedingungen ein, die untersucht werden können. Daher zielte diese Studie darauf ab, ein neues Zellkultursystem zu entwickeln, das die Eigenschaften des Gehirns mit erhöhter Zellausbeute rekapituliert, um die Anforderungen für Tiere zu reduzieren.

Ausgehend von Thomson et al. entwickelten wir ein Zellkulturmodell, das ausschließlich aus pränatalen Mäusegehirnen stammt. Diese Kulturen haben die gleichen Zellpopulationen, die gleiche Interkonnektivität und die gleichen Behandlungsmöglichkeiten wie die Rückenmarkskulturen, nur dass es im Vergleich weniger Myelinisierung gibt. Ein ZNS-In-vitro-Modell mit einer etwa dreimal höheren Zellausbeute ist jedoch effizienter, da weniger Mäuse und weniger Zeit für die Verarbeitung von Embryonen benötigt werden. Wir haben dieses einzigartige Kultursystem für mehrere nachgelagerte Anwendungen und Maßstäbe optimiert, einschließlich der Verwendung von Glasdeckgläsern für die Mikroskopieanalyse und verschiedener Größen von Kunststoff-Well-Platten, einschließlich 96-Well-Platten für die Hochdurchsatzforschung.

Protocol

Alle Tierversuche entsprachen den lokalen Gesetzen und Richtlinien für die Verwendung von Tieren und wurden von der örtlichen Ethikkommission an der Universität Glasgow genehmigt. Die Tiere wurden unter bestimmten krankheitserregerfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit dem UK Animals Scientific Procedures Act 1986 unter der Schirmherrschaft einer Projektlizenz des britischen Innenministeriums untergebracht. Für diese Studie wurden selbst gezüchtete erwachsene C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Verwendung von jungen …

Representative Results

MikroskopieKulturen, die auf Glasdeckgläsern gezüchtet wurden, eignen sich ideal für die mikroskopische Analyse. Um die Entwicklung der Kulturen zu visualisieren, wurden die Deckgläser zu mehreren Zeitpunkten von DIV0 (nach dem Anhängen der Zellen) bis DIV28 in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Die Kulturen wurden für die Immunfluoreszenzbildgebung wie zuvor beschrieben5 mit drei verschiedenen Färbekombinationen gefärbt: NG2 (unreife Oligodendrozyten) und Nestin (neuro…

Discussion

Das ZNS ist ein komplexes Netzwerk, das sich vom Gehirn bis zum Rückenmark erstreckt und aus vielen Zelltypen besteht, vor allem Neuronen, Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia1. Da jede Zelle eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der Erzeugung angemessener Reaktionen auf Herausforderungen im ZNSspielt 9,10,11, ist ein Kultursystem, das all diese Zelltypen enthält, ein nützliches und vielseitiges Werkzeug, um zu untersuchen<sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Mitgliedern des Edgar- und Linington-Labors, insbesondere Prof. Chris Linington, Dr. Diana Arseni und Dr. Katja Muecklisch, für ihre Ratschläge, hilfreichen Kommentare und Unterstützung bei der Ernährung der Kulturen während des Aufbaus dieser Kulturen. Besonderer Dank geht an Herrn Dr. Muecklisch, der die Ausgangspunkte für die Cell Profiler-Pipelines zur Verfügung gestellt hat. Diese Arbeit wurde von der MS-Gesellschaft (Stipendium 122) und der Yuri und Lorna Chernajovsky-Stiftung unterstützt. Finanzierung der Universität Glasgow für JC und MP; und Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) und Medical Research Council (MRV0109721) an GJG.

Materials

10x Trypsin Sigma T4549-100ML To digest tissue
140 mm TC Dish Fisher 11339283 Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon Sarstedt 62554502 To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle Henke Sass Wolf 4710012040 For trituration of sample
21 G needle BD 304432 For trituration of sample
23 G needle Henke Sass Wolf 4710006030 For trituration of sample
35 mm TC Dish Corning 430165 Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe Fisher 15869152 For trituration of sample
6 well plate Corning 3516 To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux Fisher DIS080010R To put brains intp
96 well plate Corning 3596 To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE Miltenyi 130-123-284 For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps Dumont 0108-5/45-PO For dissection
Biotin Sigma B4501 For DM+/-
Boric Acid Sigma B6768-500G For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 Biolegend 101825 For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 Biolegend 103139 For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 Biolegend 101243 For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V Sigma A3059-10G For SD Inhibitor
CNP Abcam AB6319 Mature oligodendrocytes
Coverslip VWR 631-0149 To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors Sigma S3146-1EA For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine Gibco 21969-035 For DM+/-, and for plating media
DNase I Thermofisher 18047019 For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I Sigma D4263 For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermofisher 65-0865-14 Live / Dead stain
Fine forceps Dumont 0102-SS135-PO For dissection
GFAP Invitrogen 13-0300 Astrocytes
HBSS w Ca Mg Sigma H9269-500ML For plating media
HBSS w/o Ca Mg Sigma H9394-500ML For brains to be added to
Horse Serum Gibco 26050-070 For plating media
Hydrocortisone Sigma H0396 For DM+/-
Iba1 Alpha-Laboratories 019-1971 Microglia
Insulin Sigma I1882 For DM+
Leibovitz L-15 GIbco 11415-049 For SD Inhibitor
MBP Bio-Rad MCA409S Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit BioTechne DY478-05 ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement Sigma N6530-5ML For DM+/-
Nestin Merck MAB353 Neuronal stem/progenitor cells
NeuN Thermofisher PA578499 Neuronal cell body
NG2 Sigma AB5320 Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC Miltenyi 130-119-155 For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep Sigma P0781-100ML For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide Sigma P1274 For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31 BioLegend 801601 Axons
Sodium Tetraborate Sigma 221732-100G For boric acid buffer
Trizol Thermofisher 15596026 For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T9003-100MG For SD Inhibitor

References

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Gamble, A., Suessmilch, M., Bonestroo, A., Merits, A., Graham, G. J., Cavanagh, J., Edgar, J. M., Pingen, M. Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity. J. Vis. Exp. (196), e65331, doi:10.3791/65331 (2023).

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