Ex Vivo Imágenes multimodales basadas en OCT de ojos de donantes humanos para la investigación de la degeneración macular relacionada con la edad

Quince años de manejo de la degeneración macular neovascular relacionada con la edad (DMAE) con terapia anti-VEGF bajo la guía de la tomografía de coherencia óptica (OCT) ha ofrecido nuevos conocimientos sobre la secuencia de progresión y la microarquitectura de esta causa prevalente de pérdida de visión. Un reconocimiento clave es que la DMAE es una enfermedad tridimensional que involucra la retina neurosensorial, el epitelio pigmentario de la retina (EPR) y la coroides. Como resultado de las imágenes de OCT de los pacientes del ensayo y los ojos de los pacientes clínicos tratados, ahora se reconocen las características de la patología más allá de las observadas por la fotografía de fondo de ojo en color, un estándar clínico durante décadas. Estos incluyen neovascularización intrarretiniana (neovascularización macular tipo 3¹, anteriormente proliferación angiomatosa), depósitos drusenoides subretinianos (SDD, también llamados pseudodrusas reticulares)², múltiples vías de destino del EPR^3,4 y células de Müller intensamente glióticas en la atrofia ^5,6.

Los sistemas modelo que carecen de máculas (células y animales) recrean algunas rebanadas de esta compleja enfermedad ^7,8,9. El éxito adicional en la mejora de la carga de la DMAE podría provenir del descubrimiento y la exploración de la patología primaria en los ojos humanos, la comprensión de la composición celular única de la mácula, seguido de la traducción a sistemas modelo. Este informe retrata una colaboración de tres décadas entre un laboratorio de investigación académica y un banco de ojos. Los objetivos de los métodos de caracterización tisular descritos en este documento son dobles: 1) informar la evolución de la tecnología de diagnóstico al demostrar la base de la apariencia del fondo de ojo y las fuentes de señales de imagen con microscopía, y 2) clasificar las muestras de DMAE para técnicas de descubrimiento molecular dirigidas (inmunohistoquímica) y no dirigidas (espectrometría de masas de imágenes, IMS y transcriptómica espacial) que preservan la fóvea y la fóvea y perifovea ricas en conos y barras. Dichos estudios podrían acelerar la traducción a OCT clínica, para lo cual es posible una secuencia de progresión y un seguimiento longitudinal a través del seguimiento ocular. Esta tecnología, que está diseñada para monitorear los efectos del tratamiento, registra escaneos de una visita clínica a la siguiente utilizando vasos retinianos. Vincular la OCT con seguimiento ocular con los resultados de laboratorio obtenidos con técnicas destructivas podría proporcionar un nuevo nivel de valor pronóstico a los hallazgos moleculares.

En 1993, el laboratorio de investigación capturó fotografías en color del fondo de ojo postmortem en la película¹⁰. Este esfuerzo fue inspirado por la excelente fotomicroscopía e histología de la retina periférica humana por Foos y colegas 11,12,13 y las extensas correlaciones clinicopatológicas de DMAE por Sarks et ^al.14,15. A partir de 2009, se adoptaron imágenes multimodales ex vivo (MMI) ancladas en OCT de dominio espectral. Esta transición fue inspirada por los esfuerzos similares de otros 16,17 y especialmente por la comprensión de que gran parte de la ultraestructura descrita por los Sarks estaba disponible en tres dimensiones, con el tiempo, en la clínica ^18,19. El objetivo era adquirir ojos con máculas adheridas en un marco de tiempo razonable para estudios con buena potencia de fenotipos a nivel celular en la retina, RPE y coroides. La intención era ir más allá de las estadísticas “por ojo” a “por tipo de lesión”, un estándar influenciado por los conceptos de “placa vulnerable” de la enfermedad cardiovascular^20,21.

El protocolo en este informe refleja la experiencia con casi 400 pares de ojos de donantes accedidos en varias corrientes. En 2011-2014, se creó el sitio web del Proyecto MACULA de histopatología de DMAE, que incluye espesores de capas y anotaciones de 142 especímenes archivados. Estos ojos se conservaron de 1996 a 2012 en un fijador de glutaraldehído-paraformaldehído para histología de resina epoxi de alta resolución y microscopía electrónica. Todos los fundi habían sido fotografiados en color cuando se recibieron y fueron reimaginados por OCT justo antes de la histología. Se utilizó un soporte para ojos diseñado originalmente para estudios del nervio óptico²² para acomodar un punzón de tejido de espesor total de 8 mm de diámetro centrado en la fóvea. Se cargaron en el sitio web exploraciones B de OCT a través del centro foveal y un sitio 2 mm superior, correspondiente a histología en los mismos niveles, además de una fotografía de fondo de ojo en color. La elección de los planos OCT fue dictada por la prominencia de la patología DMAE bajo la fóvea²³ y la prominencia de las SDD en áreas ricas en varillas superiores a la fóvea^24,25.

A partir de 2013, los ojos fotografiados con IMM anclada en OCT durante la vida estaban disponibles para correlaciones clinicopatológicas directas. La mayoría (7 de 10 donantes) involucraron a pacientes en una práctica de derivación de retina (autor: K.B.F.), que ofrecía un registro de directivas avanzadas para pacientes interesados en donar sus ojos después de la muerte con fines de investigación. Los ojos fueron recuperados y preservados por el banco de ojos local, transferidos al laboratorio y preparados de la misma manera que los ojos del Proyecto MACULA. Los volúmenes clínicos de OCT pre-mortem fueron leídos sin problemas en el laboratorio, alineando así las características patológicas observadas durante la vida con las características observadas bajo el microscopio²⁶.

A partir de 2014, la recolección prospectiva de ojos comenzó con la detección de DMAE en ojos de donantes sin antecedentes clínicos, pero conservados durante un límite de tiempo definido (6 h). Para este propósito, el soporte del ojo se modificó para acomodar todo un globo. Esto redujo la posibilidad de desprendimiento alrededor de los bordes cortados del punzón de 8 mm utilizado anteriormente. Los ojos se conservaron en paraformaldehído tamponado al 4% para inmunohistoquímica y se transfirieron al 1% al día siguiente para el almacenamiento a largo plazo. En 2016-2017 (antes de la pandemia), se recuperaron 184 ojos de 90 donantes. Las estadísticas e imágenes de este informe se generan a partir de esta serie. Durante la era de la pandemia (cierres y secuelas de 2020), las colecciones prospectivas para la transcriptómica y las colaboraciones de IMS continuaron a un ritmo reducido, esencialmente utilizando los métodos de 2014.

Existen otros métodos para la evaluación ocular del donante. El Minnesota Grading System (MGS)^27,28 se basa en el sistema clínico AREDS para la fotografía de fondo de ojo en color ²⁹. Las limitaciones de este método incluyen la combinación de DMAE atrófica y neovascular en una etapa de “DMAE tardía”. Además, el MGS implica la extirpación de la retina neurosensorial antes de la fotodocumentación de la coroides del EPR. Este paso desaloja las SDD en diversos grados^30,31 y elimina la correspondencia espacial de la retina externa y su sistema de soporte. Por lo tanto, los esfuerzos para vincular la demanda metabólica y la señalización de la retina a la patología en el EPR-coroides pueden verse obstaculizados. El Sistema de Utah implementó MMI utilizando fotografía en color ex vivo y OCT para categorizar los ojos destinados a la disección en regiones para extracciones de ARN y proteínas³². Aunque es preferible a las extracciones enteras del ocular, el área de 3 mm de diámetro con mayor riesgo de progresión de la DMAE^33,34 representa solo el 25% de un punzón centrado en la fóvea de 6 mm de diámetro. Por lo tanto, las técnicas que pueden localizar los hallazgos en referencia a la fóvea, como la sección seriada para inmunohistoquímica, son ventajosas.