エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

光干渉断層撮影(OCT)の指導の下で抗VEGF療法で血管新生加齢黄斑変性症(AMD)を管理してきた15年間は、視力喪失のこの一般的な原因の進行シーケンスとマイクロアーキテクチャに新しい洞察を提供しました。重要な認識は、AMDが神経感覚網膜、網膜色素上皮(RPE)、および脈絡膜を含む三次元疾患であるということです。治験患者や治療を受けた臨床患者の仲間の目のOCTイメージングの結果、何十年にもわたって臨床標準であったカラー眼底写真で見られる以上の病理の特徴が認識されるようになりました。これらには、網膜内血管新生(3型黄斑新生^血管1、以前は血管腫性増殖)、網膜下ドルセノイド沈着物(SDD、網様偽ドルーゼンとも呼ばれる)²、RPE運命の複数の経路^3,4、および萎縮における激しい神経膠生物ミュラー細胞^5,6が含まれます。

黄斑(細胞と動物)を欠くモデルシステムは、この複雑な病気のいくつかのスライスを再現します^7,8,9。AMDの負担を改善するさらなる成功は、人間の目の原発病理の発見と探索、黄斑のユニークな細胞組成の理解、それに続くモデルシステムへの翻訳からもたらされる可能性があります。このレポートは、学術研究所とアイバンクの30年間のコラボレーションを描いています。本明細書に記載の組織特性評価法の目標は、1)顕微鏡で眼底の外観と画像化シグナル源の基礎を実証することにより、進化する診断技術に情報を提供すること、2)AMD標本を標的(免疫組織化学)および非標的分子探索技術(イメージング質量分析、IMS、および空間トランスクリプトミクス)のために分類することであり、錐体のみの中心窩と桿状に富む傍中心窩および中心窩を保存します。このような研究は、アイトラッキングを通じて進行シーケンスと縦断的フォローアップが可能な臨床OCTへの翻訳を加速する可能性があります。治療効果を監視するように設計されたこの技術は、網膜血管を使用して、あるクリニック訪問から次のクリニック訪問へのスキャンを登録します。眼球追跡OCTを破壊的技術で得られた検査結果にリンクさせることは、分子所見に新しいレベルの予後価値を提供する可能性があります。

1993年、研究所は死後の眼底のカラー写真をフィルム¹⁰に撮影しました。この取り組みは、Foosらによるヒト末梢網膜の優れた顕微鏡検査と組織学11,12,13と、Sarksらによる広範なAMD臨床病理学的相関に触発されました^14,15。2009年から、スペクトルドメインOCTに固定されたex vivoマルチモーダルイメージング(MMI)が採用されました。この移行は、他の人の同様の努力^16,17、特にサークスによって記述された超微細構造の多くが、時間の経過とともにクリニックで3次元で利用可能であるという認識に触発されました^18,19。目標は、網膜、RPE、および脈絡膜における細胞レベルの表現型の十分な検出力のある研究のために、妥当な時間枠で黄斑が付着した目を取得することでした。その意図は、「目ごと」の統計を超えて、心血管疾患の「脆弱なプラーク」の概念の影響を受けた基準である「病変タイプごと」に移行することでした^20,21。

このレポートのプロトコルは、いくつかのストリームでアクセッションされた約400組のドナーアイの経験を反映しています。2011年から2014年にかけて、AMD組織病理学のプロジェクトMACULAウェブサイトが作成され、142のアーカイブされた標本からの層の厚さと注釈が含まれています。これらの眼は、高分解能エポキシ樹脂組織学および電子顕微鏡観察のために、1996年から2012年までグルタルアルデヒド-パラホルムアルデヒド固定剤で保存されました。すべてのファンディは、受け取ったときにカラーで撮影され、組織学の直前にOCTによって再画像化されました。もともと視神経研究用に設計されたアイ^{ホルダー22}を使用して、中心窩を中心とした直径8mmの全層組織パンチを収容しました。中心窩の中心と2 mm上の部位を通るOCT Bスキャンは、同じレベルの組織学に対応し、カラー眼底写真をウェブサイトにアップロードしました。OCT平面の選択は、中心窩²³の下のAMD病理の卓越性と、中心窩^24,25よりも優れた桿体が豊富な領域でのSDDの卓越性によって決定されました。

2013年以降、生涯にOCTアンカーMMIで画像化された目は、直接的な臨床病理学的相関のために利用可能になりました。ほとんど(10人のドナーのうち7人)は、研究目的で死後に眼を提供することに関心のある患者に高度な指令レジストリを提供する網膜紹介診療所(著者:KBF)の患者に関係していました。眼は地元のアイバンクによって回収・保存され、研究所に移され、プロジェクトMACULAの目と同じ方法で準備されました。死前の臨床OCTボリュームは実験室でシームレスに読み取られ、したがって、人生の間に見られる病理学的特徴を顕微鏡下で見られる特徴と一致させた²⁶。

2014年以降、前向き眼球採集は、病歴のないドナー眼でAMDのスクリーニングから始まりましたが、定義された制限時間(6時間)の間保存されました。この目的のために、アイホルダーは地球全体を収容するように変更されました。これにより、以前に使用されていた8 mmパンチのカットエッジの周りで剥離する可能性が減少しました。眼は免疫組織化学のために4%緩衝パラホルムアルデヒドで保存され、長期保存のために翌日1%に移されました。2016年から2017年(パンデミック前)に、90人のドナーから184の目が回復しました。このレポートの統計情報と画像は、このシリーズから生成されます。パンデミックの時代(2020年の封鎖と余波)の間、トランスクリプトミクスとIMSコラボレーションの将来の収集は、基本的に2014年の方法を使用して、ペースを下げて継続しました。

ドナーの目の評価のための他の方法が利用可能です。ミネソタグレーディングシステム(MGS)^27,28は、カラー眼底写真用のAREDS臨床システムに基づいています²⁹。この方法の限界には、萎縮性AMDと新生血管性AMDを「後期AMD」の1つの段階に組み合わせることが含まれます。さらに、MGSは、RPE脈絡膜の写真記録の前に神経感覚網膜の除去を伴う。このステップは、SDDをさまざまな程度^30,31に取り除き、外側網膜とそのサポートシステムの空間的対応を取り除きます。したがって、網膜からの代謝要求とシグナル伝達をRPE脈絡膜の病理に結び付ける努力が妨げられる可能性があります。ユタシステムは、ex vivoカラー写真とOCTを使用してMMIを実装し、解剖される予定の目をRNAおよびタンパク質抽出用の領域に分類しました³²。アイカップ全体の抜歯よりも好ましいが、AMD進行^33,34のリスクが最も高い直径^3mmの領域は、直径6mmの中心窩中心のパンチの25%に過ぎない。したがって、免疫組織化学のための連続切片化など、中心窩を参照して所見を局在化できる技術が有利である。