Ex Vivo Imaging multimodale basato su OCT di occhi di donatori umani per la ricerca sulla degenerazione maculare legata all'età

Quindici anni di gestione della degenerazione maculare legata all’età (AMD) neovascolare con terapia anti-VEGF sotto la guida della tomografia a coerenza ottica (OCT) hanno offerto nuove conoscenze sulla sequenza di progressione e sulla microarchitettura di questa causa prevalente di perdita della vista. Un riconoscimento chiave è che l’AMD è una malattia tridimensionale che coinvolge la retina neurosensoriale, l’epitelio pigmentato retinico (RPE) e la coroide. Come risultato dell’imaging OCT dei pazienti dello studio e degli occhi dei pazienti della clinica trattati, le caratteristiche della patologia oltre a quelle viste dalla fotografia del fondo oculare a colori, uno standard clinico per decenni, sono ora riconosciute. Questi includono neovascolarizzazione intraretinica (neovascolarizzazione maculare di tipo 3¹, precedentemente proliferazione angiomatosa), depositi drusenoidi sottoretinici (SDD, chiamati anche pseudodrusen reticolari)², vie multiple del destino RPE^3,4 e cellule di Müller intensamente gliotiche nell’atrofia ^5,6.

Sistemi modello privi di macule (cellule e animali) ricreano alcune fette di questa complessa malattia ^7,8,9. Un ulteriore successo nel migliorare l’onere dell’AMD potrebbe venire dalla scoperta e dall’esplorazione della patologia primaria negli occhi umani, dalla comprensione della composizione cellulare unica della macula, seguita dalla traduzione in sistemi modello. Questo rapporto ritrae una collaborazione trentennale tra un laboratorio di ricerca accademica e una banca degli occhi. Gli obiettivi dei metodi di caratterizzazione tissutale descritti nel presente documento sono duplici: 1) informare la tecnologia diagnostica in evoluzione dimostrando le basi dell’aspetto del fondo oculare e delle sorgenti di segnali di imaging con la microscopia e 2) classificare i campioni di AMD per tecniche di scoperta molecolare mirate (immunoistochimica) e non mirate (spettrometria di massa di imaging, IMS e trascrittomica spaziale) che preservano la fovea a solo cono e la para- e perifovea ricche di bastoncelli. Tali studi potrebbero accelerare la traduzione in OCT clinico, per il quale una sequenza di progressione e un follow-up longitudinale sono possibili attraverso l’eye-tracking. Questa tecnologia, progettata per monitorare gli effetti del trattamento, registra le scansioni da una visita clinica all’altra utilizzando vasi retinici. Collegare l’OCT tracciato oculmente ai risultati di laboratorio ottenuti con tecniche distruttive potrebbe fornire un nuovo livello di valore prognostico ai risultati molecolari.

Nel 1993, il laboratorio di ricerca ha catturato fotografie a colori del fondo oscuro postmortem sulla pellicola¹⁰. Questo sforzo è stato ispirato dalla superba fotomicroscopia e istologia della retina periferica umana di Foos e colleghi 11,12,13 e dalle estese correlazioni clinico-patologiche AMD di Sarks et ^al.14,15. A partire dal 2009, è stato adottato l’imaging multimodale ex vivo (MMI) ancorato sul dominio spettrale OCT. Questa transizione è stata ispirata dagli sforzi simili di altri 16,17 e soprattutto dalla consapevolezza che gran parte dell’ultrastruttura descritta dai Sark era disponibile in tre dimensioni, nel tempo, nella clinica ^18,19. L’obiettivo era quello di acquisire occhi con macule attaccate in un lasso di tempo ragionevole per studi ben potenziati dei fenotipi a livello cellulare nella retina, RPE e coroide. L’intento era quello di andare oltre le statistiche “per occhio” a “per tipo di lesione”, uno standard influenzato dai concetti di “placca vulnerabile” della malattia cardiovascolare^20,21.

Il protocollo in questo rapporto riflette l’esperienza con quasi 400 paia di occhi di donatori accesi in diversi flussi. Nel 2011-2014 è stato creato il sito Web Project MACULA di istopatologia AMD, che include spessori di strato e annotazioni da 142 campioni archiviati. Questi occhi sono stati conservati dal 1996 al 2012 in un fissativo glutaraldeide-paraformaldeide per istologia epossi-resina ad alta risoluzione e microscopia elettronica. Tutti i fundi erano stati fotografati a colori quando ricevuti e sono stati ripresi da OCT poco prima dell’istologia. Un supporto per gli occhi originariamente progettato per gli studi sul nervo ottico²² è stato utilizzato per ospitare un punzone tissutale a tutto spessore di 8 mm di diametro centrato sulla fovea. Le scansioni OCT B attraverso il centro foveale e un sito 2 mm superiore, corrispondente all’istologia agli stessi livelli, sono state caricate sul sito web, oltre a una fotografia del fondo oculare a colori. La scelta dei piani OCT è stata dettata dalla preminenza della patologia AMD sotto la fovea²³ e dalla prominenza degli SDD in aree ricche di bastoncelli superiori alla fovea^24,25.

A partire dal 2013, gli occhi ripresi con MMI ancorato all’OCT durante la vita erano disponibili per correlazioni clinicopatologiche dirette. La maggior parte (7 donatori su 10) ha coinvolto pazienti in uno studio di riferimento della retina (autore: K.B.F.), che ha offerto un registro di direttive avanzate per i pazienti interessati a donare i loro occhi dopo la morte per scopi di ricerca. Gli occhi sono stati recuperati e conservati dalla banca degli occhi locale, trasferiti al laboratorio e preparati allo stesso modo degli occhi del Progetto MACULA. I volumi OCT clinici pre-mortem sono stati letti senza soluzione di continuità in laboratorio, allineando così le caratteristiche patologiche osservate durante la vita con le caratteristiche osservate al microscopio²⁶.

A partire dal 2014, la raccolta oculare prospettica è iniziata con lo screening per AMD in occhi di donatori senza anamnesi clinica ma conservati entro un limite di tempo definito (6 ore). A tale scopo, il supporto dell’occhio è stato modificato per ospitare un intero globo. Ciò ha ridotto la possibilità di distacco attorno ai bordi tagliati del punzone da 8 mm precedentemente utilizzato. Gli occhi sono stati conservati in paraformaldeide tamponata al 4% per l’immunoistochimica e trasferiti all’1% il giorno successivo per la conservazione a lungo termine. Nel 2016-2017 (pre-pandemia) sono stati recuperati 184 occhi di 90 donatori. Le statistiche e le immagini in questo report sono generate da questa serie. Durante l’era della pandemia (lockdown e conseguenze del 2020), le raccolte prospettiche per la trascrittomica e le collaborazioni IMS sono proseguite a un ritmo ridotto, utilizzando essenzialmente i metodi del 2014.

Sono disponibili altri metodi per la valutazione dell’occhio del donatore. Il Minnesota Grading System (MGS)^27,28 si basa sul sistema clinico AREDS per la fotografia del fondo oculare a colori ²⁹. I limiti di questo metodo includono la combinazione di AMD atrofica e neovascolare in uno stadio di “AMD tardiva”. Inoltre, l’MGS comporta la rimozione della retina neurosensoriale prima della foto-documentazione della coroide RPE. Questo passaggio rimuove gli SDD a vari gradi^30,31 e rimuove la corrispondenza spaziale della retina esterna e del suo sistema di supporto. Pertanto, gli sforzi per collegare la domanda metabolica e la segnalazione dalla retina alla patologia nella RPE-coroide possono essere ostacolati. Il sistema Utah ha implementato MMI utilizzando la fotografia a colori ex vivo e l’OCT per classificare gli occhi destinati alla dissezione in regioni per l’estrazione di RNA e proteine³². Sebbene preferibile alle estrazioni a coppa oculare intera, l’area di 3 mm di diametro a più alto rischio di progressione AMD^33,34 rappresenta solo il 25% di un punch centrato sulla fovea di 6 mm di diametro. Pertanto, le tecniche in grado di localizzare i risultati in riferimento alla fovea, come il sezionamento seriale per l’immunoistochimica, sono vantaggiose.