Ex Vivo OCT-gebaseerde multimodale beeldvorming van menselijke donorogen voor onderzoek naar leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Vijftien jaar beheer van neovasculaire leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) met anti-VEGF-therapie onder begeleiding van optische coherentietomografie (OCT) heeft nieuwe inzichten geboden in de progressievolgorde en microarchitectuur van deze veel voorkomende oorzaak van verlies van het gezichtsvermogen. Een belangrijke erkenning is dat AMD een driedimensionale ziekte is waarbij het neurosensorische netvlies, retinale pigmentepitheel (RPE) en vaatvlies betrokken zijn. Als gevolg van de OCT-beeldvorming van proefpatiënten en de collega-ogen van behandelde kliniekpatiënten, worden de kenmerken van pathologie die verder gaan dan die van kleurenfundusfotografie, al tientallen jaren een klinische standaard, nu erkend. Deze omvatten intraretinale neovascularisatie (type 3 maculaire neovascularisatie¹, voorheen angiomateuze proliferatie), subretinale drusenoïde afzettingen (SDD’s, ook wel reticulaire pseudodrusen genoemd)², meerdere routes van RPE-lot^3,4 en intens gliotische Müller-cellen in atrofie ^5,6.

Modelsystemen zonder macula’s (cellen en dieren) recreëren enkele plakjes van deze complexe ziekte ^7,8,9. Verder succes bij het verbeteren van de last van AMD zou kunnen komen van de ontdekking en verkenning van primaire pathologie in menselijke ogen, het begrijpen van de unieke cellulaire samenstelling van de macula, gevolgd door vertaling naar modelsystemen. Dit rapport schetst een drie decennia durende samenwerking tussen een academisch onderzoekslaboratorium en een oogbank. De doelen van de weefselkarakteriseringsmethoden die hierin worden beschreven, zijn tweeledig: 1) om evoluerende diagnostische technologie te informeren door de basis van fundusverschijning en beeldvormingssignaalbronnen met microscopie aan te tonen, en 2) om AMD-monsters te classificeren voor gerichte (immunohistochemie) en ongerichte moleculaire ontdekkingstechnieken (beeldvormende massaspectrometrie, IMS en ruimtelijke transcriptomica) die de kegel-only fovea en staafrijke para- en perifovea behouden. Dergelijke studies zouden de vertaling naar klinische OCT kunnen versnellen, waarvoor een progressiesequentie en longitudinale follow-up mogelijk zijn door middel van eye-tracking. Deze technologie, die is ontworpen om de effecten van de behandeling te controleren, registreert scans van het ene kliniekbezoek naar het volgende met behulp van retinale vaten. Het koppelen van oog-gevolgde OCT aan laboratoriumresultaten verkregen met destructieve technieken zou een nieuw niveau van prognostische waarde kunnen bieden aan moleculaire bevindingen.

In 1993 maakte het onderzoekslaboratorium kleurenfoto’s van postmortale fundus op film¹⁰. Deze inspanning werd geïnspireerd door de uitstekende fotomicroscopie en histologie van het menselijke perifere netvlies door Foos en collega’s 11,12,13 en de uitgebreide AMD clinicopathologische correlaties door Sarks et ^al.14,15. Vanaf 2009 werd ex vivo multimodale beeldvorming (MMI) verankerd op spectraal domein OCT aangenomen. Deze overgang werd geïnspireerd door de soortgelijke inspanningen van anderen 16,17 en vooral door het besef dat zoveel van de door de Sarken beschreven ultrastructuur in drie dimensies beschikbaar was, in de loop van de tijd, in de kliniek ^18,19. Het doel was om ogen te krijgen met aangehechte macula’s in een redelijk tijdsbestek voor goed aangedreven studies van fenotypes op cellulair niveau in het netvlies, RPE en vaatvlies. De bedoeling was om verder te gaan dan “per oog” statistieken naar “per laesie type”, een standaard beïnvloed door de “kwetsbare plaque” concepten van hart- en vaatziekten^20,21.

Het protocol in dit rapport weerspiegelt de ervaring met bijna 400 paar donorogen die in verschillende stromen zijn toegevoegd. In 2011-2014 werd de Project MACULA-website van AMD histopathology gemaakt, die laagdiktes en annotaties van 142 gearchiveerde exemplaren bevat. Deze ogen werden bewaard van 1996-2012 in een glutaaraldehyde-paraformaldehydefixatief voor hoge resolutie epoxyhars histologie en elektronenmicroscopie. Alle fundi waren bij ontvangst in kleur gefotografeerd en werden vlak voor de histologie door OCT opnieuw in beeld gebracht. Een ooghouder die oorspronkelijk was ontworpen voor oogzenuwstudies²² werd gebruikt om plaats te bieden aan een weefselpons van 8 mm met een diameter van volledige dikte gecentreerd op de fovea. OCT B-scans door het foveale centrum en een site 2 mm superieur, overeenkomend met histologie op dezelfde niveaus, werden geüpload naar de website, plus een kleurenfundusfoto. De keuze van de LGO-vliegtuigen werd bepaald door de prominentie van AMD-pathologie onder de fovea²³ en de prominentie van SDD’s in staafrijke gebieden die superieur zijn aan de fovea^24,25.

Vanaf 2013 waren ogen die tijdens het leven met OCT-verankerde MMI in beeld waren gebracht beschikbaar voor directe clinicopathologische correlaties. De meeste (7 van de 10 donoren) betroffen patiënten in een verwijzingspraktijk voor het netvlies (auteur: K.B.F.), die een geavanceerd richtlijnregister aanbood voor patiënten die geïnteresseerd waren in het doneren van hun ogen na de dood voor onderzoeksdoeleinden. De ogen werden hersteld en bewaard door de lokale oogbank, overgebracht naar het laboratorium en op dezelfde manier voorbereid als de Project MACULA-ogen. Premortale klinische OCT-volumes werden naadloos gelezen in het laboratorium, waardoor de pathologiekenmerken die tijdens het leven werden gezien, werden afgestemd op de kenmerken die onder de microscoop^{werden gezien 26}.

Vanaf 2014 begon prospectieve oogverzameling met screening op AMD in donorogen zonder klinische voorgeschiedenis, maar bewaard gedurende een gedefinieerde tijdslimiet (6 uur). Voor dit doel werd de ooghouder aangepast om plaats te bieden aan een hele wereldbol. Dit verkleinde de kans op loslating rond de snijranden van de eerder gebruikte 8 mm pons. De ogen werden bewaard in 4% gebufferd paraformaldehyde voor immunohistochemie en de volgende dag overgebracht naar 1% voor langdurige opslag. In 2016-2017 (pre-pandemie) werden 184 ogen van 90 donoren hersteld. De statistieken en afbeeldingen in dit rapport zijn gegenereerd uit deze serie. Tijdens het pandemietijdperk (lockdowns en nasleep van 2020) gingen prospectieve collecties voor transcriptomics en IMS-samenwerkingen in een lager tempo door, voornamelijk met behulp van de methoden van 2014.

Er zijn andere methoden voor donoroogbeoordeling beschikbaar. Het Minnesota Grading System (MGS)^27,28 is gebaseerd op het AREDS klinische systeem voor kleurenfundusfotografie ²⁹. De beperkingen van deze methode omvatten het combineren van atrofische en neovasculaire AMD in één stadium van “late AMD”. Verder omvat de MGS de verwijdering van het neurosensorische netvlies vóór de fotodocumentatie van het RPE-vaatvlies. Deze stap verwijdert SDD’s in verschillende mate^30,31 en verwijdert de ruimtelijke correspondentie van het buitenste netvlies en het ondersteunende systeem. Pogingen om metabole vraag en signalering van het netvlies te koppelen aan pathologie in het RPE-vatoïde kunnen dus worden belemmerd. Het Utah-systeem implementeerde MMI met behulp van ex vivo kleurenfotografie en OCT om ogen bestemd voor dissectie te categoriseren in regio’s voor RNA- en eiwitextracties³². Hoewel het de voorkeur verdient boven extracties met hele oogschelpen, vertegenwoordigt het gebied met een diameter van 3 mm met het hoogste risico op AMD-progressie^33,34 slechts 25% van een fovea-gecentreerde pons met een diameter van 6 mm. Technieken die bevindingen kunnen lokaliseren met betrekking tot de fovea, zoals seriële secties voor immunohistochemie, zijn dus voordelig.