Ex Vivo Imagem Multimodal Baseada em OCT de Olhos de Doadores Humanos para Pesquisa em Degeneração Macular Relacionada à Idade

Quinze anos de manejo da degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI) com terapia anti-VEGF sob a orientação da tomografia de coerência óptica (OCT) ofereceram novos insights sobre a sequência de progressão e a microarquitetura dessa causa prevalente de perda de visão. Um reconhecimento importante é que a DMRI é uma doença tridimensional que envolve a retina neurossensorial, o epitélio pigmentado da retina (EPR) e a coroide. Como resultado das imagens de OCT de pacientes do estudo e dos olhos de pacientes clínicos tratados, as características da patologia além daquelas vistas pela fotografia de fundo de olho colorido, um padrão clínico por décadas, são agora reconhecidas. Estes incluem neovascularização intrarretiniana (neovascularização macular tipo 3¹, anteriormente proliferação angiomatosa), depósitos drusenoides sub-retinianos (SDDs, também chamados pseudodrusen reticulares)², múltiplas vias do destino do EPR^3,4 e células de Müller intensamente glióticas em atrofia ^5,6.

Sistemas modelo desprovidos de máculas (células e animais) recriam algumas fatias dessa complexa doença ^7,8,9. Mais sucesso em melhorar a carga da DMRI poderia vir da descoberta e exploração da patologia primária em olhos humanos, entendendo a composição celular única da mácula, seguida de tradução para sistemas modelo. Este relatório retrata uma colaboração de três décadas entre um laboratório de pesquisa acadêmica e um banco de olhos. Os objetivos dos métodos de caracterização tecidual aqui descritos são dois: 1) informar a evolução da tecnologia diagnóstica, demonstrando a base da aparência do fundo de olho e fontes de sinal de imagem com microscopia, e 2) classificar espécimes de DMRI para técnicas de descoberta molecular direcionadas (imunohistoquímica) e não direcionadas (espectrometria de massa por imagem, IMS e transcriptômica espacial) que preservam a fóvea somente cônica e a para- e perifovea ricas em bastonetes. Tais estudos poderiam acelerar a tradução para OCT clínica, para a qual uma sequência de progressão e acompanhamento longitudinal são possíveis por meio do rastreamento ocular. Essa tecnologia, projetada para monitorar os efeitos do tratamento, registra exames de uma consulta clínica para outra usando vasos da retina. Associar a OCT rastreada pelos olhos aos resultados laboratoriais obtidos com técnicas destrutivas poderia fornecer um novo nível de valor prognóstico aos achados moleculares.

Em 1993, o laboratório de pesquisa capturou fotografias coloridas de fundo de olho post-mortem no filme¹⁰. Esse esforço foi inspirado na soberba fotomicroscopia e histologia da retina periférica humana de Foos e colaboradores11,12,13 e nas extensas correlações clínico-patológicas da DMRI de Sarks et al.14,15. A partir de 2009, a imagem multimodal (IHM) ex vivo ancorada na OCT de domínio espectral foi adotada. Essa transição foi inspirada pelos esforços semelhantes de outros 16,17 e, principalmente, pela constatação de que grande parte da ultraestrutura descrita pelos Sarks estava disponível em três dimensões, ao longo do tempo, na clínica ^18,19. O objetivo era adquirir olhos com máculas aderidas em um prazo razoável para estudos bem fundamentados dos fenótipos em nível celular na retina, PSE e coroide. A intenção era ir além da estatística “por olho” para “por tipo de lesão”, padrão influenciado pelos conceitos de “placa vulnerável” das doenças^{cardiovasculares20,21}.

O protocolo deste relato reflete a experiência com cerca de 400 pares de olhos doadores acessados em vários fluxos. Em 2011-2014, foi criado o site do Projeto MACULA de histopatologia da AMD, que inclui espessuras de camadas e anotações de 142 espécimes arquivados. Esses olhos foram preservados de 1996 a 2012 em fixador de glutaraldeído-paraformaldeído para histologia de alta resolução de resina epóxi e microscopia eletrônica. Todos os fundos de fundo foram fotografados coloridos quando recebidos e refotografados pela OCT imediatamente antes da histologia. Um suporte ocular originalmente projetado para estudos do nervo óptico²² foi usado para acomodar um punch de tecido de espessura total de 8 mm de diâmetro centrado na fóvea. OCT B-scans através do centro foveal e um local 2 mm superior, correspondente à histologia nos mesmos níveis, foram enviados para o site, além de uma fotografia de fundo de olho colorida. A escolha dos planos da OCT foi ditada pela proeminência da patologia da DMRI sob a fóvea²³ e pela proeminência dos SDDs em áreas ricas em bastonetes superiores à fóvea^24,25.

A partir de 2013, olhos com MMI ancorados em OCT durante a vida estavam disponíveis para correlações clinicopatológicas diretas. A maioria (7 de 10 doadores) envolveu pacientes em uma clínica de referência de retina (autor: K.B.F.), que oferecia um registro diretivo avançado para pacientes interessados em doar seus olhos após a morte para fins de pesquisa. Os olhos foram recuperados e preservados pelo banco de olhos local, transferidos para o laboratório e preparados da mesma forma que os olhos do Projeto MACULA. Os volumes clínicos de OCT pré-mortem foram lidos perfeitamente em laboratório, alinhando as características patológicas observadas durante a vida com as características vistas ao microscópio²⁶.

A partir de 2014, a coleta prospectiva de olhos começou pela triagem para DMRI em olhos de doadores sem história clínica, mas preservados durante um limite de tempo definido (6 h). Para isso, o suporte para os olhos foi modificado para acomodar um globo inteiro. Isso reduziu a chance de descolamento ao redor das bordas de corte do punch de 8 mm usado anteriormente. Os olhos foram preservados em paraformaldeído tamponado a 4% para imunohistoquímica e transferidos para 1% no dia seguinte para armazenamento a longo prazo. Em 2016-2017 (pré-pandemia), foram recuperados 184 olhos de 90 doadores. As estatísticas e imagens deste relatório são geradas a partir desta série. Durante a era pandêmica (lockdowns e consequências de 2020), as coletas prospectivas para colaborações transcriptômicas e IMS continuaram em um ritmo reduzido, essencialmente usando os métodos de 2014.

Outros métodos para avaliação ocular do doador estão disponíveis. O Minnesota Grading System (MGS)^27,28 é baseado no sistema clínico AREDS para fotografia de fundo de olho^colorido29. As limitações desse método incluem a combinação de DMRI atrófica e neovascular em um estágio de “DMRI tardia”. Além disso, a MGS envolve a remoção da retina neurossensorial antes da fotodocumentação da coroide do EPR. Essa etapa desloca os DDS em graus variados^30,31 e remove a correspondência espacial da retina externa e seu sistema de suporte. Assim, esforços para relacionar a demanda metabólica e a sinalização da retina à patologia na PSE-coróide podem ser impedidos. O Sistema Utah implementou a MMI usando fotografia colorida ex vivo e OCT para categorizar os olhos destinados à dissecção em regiões para extração de RNA e proteína³². Embora preferível às extrações inteiras da ocular, a área de 3 mm de diâmetro com maior risco de progressão da DMRI^33,34 representa apenas 25% de um punch centrado na fóvea de 6 mm de diâmetro. Assim, técnicas que possam localizar achados referentes à fóvea, como cortes seriados para imuno-histoquímica, são vantajosas.