Ex Vivo Imagerie multimodale basée sur l’OCT des yeux de donneurs humains pour la recherche sur la dégénérescence maculaire liée à l’âge

Quinze années de prise en charge de la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l’âge (DMLA) avec un traitement anti-VEGF sous la direction de la tomographie par cohérence optique (OCT) ont offert de nouvelles perspectives sur la séquence de progression et la microarchitecture de cette cause répandue de perte de vision. Une reconnaissance clé est que la DMLA est une maladie tridimensionnelle impliquant la rétine neurosensorielle, l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et la choroïde. Grâce à l’imagerie OCT des patients de l’essai et des yeux des patients traités en clinique, les caractéristiques de la pathologie au-delà de celles observées par la photographie couleur du fond d’œil, une norme clinique depuis des décennies, sont maintenant reconnues. Il s’agit notamment de la néovascularisation intrarétinienne (néovascularisation maculaire de type 3 1, anciennement prolifération angiomateuse), des dépôts druzenoïdes sous-rétiniens (SDD, également appelés pseudodruzen réticulaires)², des voies multiples du destin RPE^3,4 et des cellules^de Müller intensément gliotiques dans l’atrophie ^5,6.

Les systèmes modèles dépourvus de maculas (cellules et animaux) recréent quelques tranches de cette maladie complexe ^7,8,9. Un autre succès dans l’amélioration du fardeau de la DMLA pourrait provenir de la découverte et de l’exploration de la pathologie primaire dans les yeux humains, de la compréhension de la composition cellulaire unique de la macula, suivie de la traduction en systèmes modèles. Ce rapport décrit une collaboration de trois décennies entre un laboratoire de recherche universitaire et une banque d’yeux. Les objectifs des méthodes de caractérisation tissulaire décrites ici sont doubles : 1) éclairer l’évolution de la technologie diagnostique en démontrant la base de l’apparence du fond d’œil et des sources de signaux d’imagerie par microscopie, et 2) classer les échantillons de DMLA pour des techniques de découverte moléculaire ciblées (immunohistochimie) et non ciblées (spectrométrie de masse d’imagerie, IMS et transcriptomique spatiale) qui préservent la fovéa conique et la para- et périfovéa riches en bâtonnets. De telles études pourraient accélérer la traduction en OCT clinique, pour laquelle une séquence de progression et un suivi longitudinal sont possibles grâce au suivi oculaire. Cette technologie, conçue pour surveiller les effets du traitement, enregistre les scans d’une visite clinique à l’autre à l’aide de vaisseaux rétiniens. L’établissement d’un lien entre la TCO suivie oculaire et les résultats de laboratoire obtenus à l’aide de techniques destructrices pourrait fournir un nouveau niveau de valeur pronostique aux résultats moléculaires.

En 1993, le laboratoire de recherche a capturé des photographies couleur de fond d’œil post-mortem sur film¹⁰. Cet effort a été inspiré par la superbe photomicroscopie et histologie de la rétine périphérique humaine par Foos et ses collègues 11,12,13 et les corrélations clinicopathologiques étendues de la DMLA par Sarks et ^al.14,15. À partir de 2009, l’imagerie multimodale ex vivo (MMI) ancrée sur le domaine spectral OCT a été adoptée. Cette transition a été inspirée par les efforts similaires d’autres 16,17 et surtout par la prise de conscience qu’une grande partie de l’ultrastructure décrite par les Sercs était disponible en trois dimensions, au fil du temps, dans la clinique ^18,19. L’objectif était d’acquérir des yeux avec des maculas attachées dans un délai raisonnable pour des études bien puissantes des phénotypes au niveau cellulaire dans la rétine, l’EPR et la choroïde. L’intention était d’aller au-delà des statistiques « par œil » pour aller au-delà des statistiques « par type de lésion », une norme influencée par les concepts de « plaque vulnérable » des maladies cardiovasculaires^20,21.

Le protocole présenté dans le présent rapport reflète l’expérience acquise avec près de 400 paires d’yeux de donneurs acquises dans plusieurs flux. En 2011-2014, le site Web du projet MACULA sur l’histopathologie de la DMLA a été créé, qui comprend des épaisseurs de couche et des annotations provenant de 142 spécimens archivés. Ces yeux ont été conservés de 1996 à 2012 dans un fixateur glutaraldéhyde-paraformaldéhyde pour l’histologie époxy-résine haute résolution et la microscopie électronique. Tous les fundi avaient été photographiés en couleur lors de leur réception et ont été réimagés par OCT juste avant l’histologie. Un porte-œil conçu à l’origine pour les études du nerf optique²² a été utilisé pour accueillir un poinçon tissulaire de 8 mm de diamètre sur toute l’épaisseur centré sur la fovéa. Des scans OCT B à travers le centre fovéal et un site supérieur de 2 mm, correspondant à l’histologie aux mêmes niveaux, ont été téléchargés sur le site Web, ainsi qu’une photographie du fond d’œil en couleur. Le choix des plans OCT a été dicté par l’importance de la pathologie AMD sous la fovéa²³ et l’importance des SDD dans les zones riches en bâtonnets supérieures à la fovéa^24,25.

À partir de 2013, les yeux imagés avec un MMI ancré dans les OCT pendant la vie étaient disponibles pour des corrélations clinicopathologiques directes. La plupart (7 donneurs sur 10) impliquaient des patients dans une pratique de référence de la rétine (auteur: K.B.F.), qui offrait un registre de directives avancées pour les patients intéressés à donner leurs yeux après leur décès à des fins de recherche. Les yeux ont été récupérés et préservés par la banque d’yeux locale, transférés au laboratoire et préparés de la même manière que les yeux du projet MACULA. Les volumes cliniques d’OCT pré-mortem ont été lus de manière transparente en laboratoire, alignant ainsi les caractéristiques pathologiques observées au cours de la vie avec les caractéristiques observées au microscope²⁶.

À partir de 2014, le prélèvement prospectif sur les yeux a commencé par le dépistage de la DMLA dans les yeux de donneurs sans antécédents cliniques, mais conservés pendant un délai défini (6 h). À cette fin, le porte-œil a été modifié pour accueillir un globe entier. Cela réduisait le risque de détachement autour des bords coupés du poinçon de 8 mm précédemment utilisé. Les yeux ont été conservés dans du paraformaldéhyde tamponné à 4% pour l’immunohistochimie et transférés à 1% le lendemain pour un stockage à long terme. En 2016-2017 (avant la pandémie), 184 yeux de 90 donneurs ont été récupérés. Les statistiques et les images de ce rapport sont générées à partir de cette série. Pendant la période pandémique (confinements de 2020 et conséquences), les collectes potentielles pour la transcriptomique et les collaborations IMS se sont poursuivies à un rythme réduit, utilisant essentiellement les méthodes de 2014.

D’autres méthodes d’évaluation oculaire du donneur sont disponibles. Le Minnesota Grading System (MGS)^27,28 est basé sur le système clinique AREDS pour la photographie couleur^{du fond d’œil 29}. Les limites de cette méthode comprennent la combinaison de la DMLA atrophique et néovasculaire en un seul stade de « DMLA tardive ». De plus, le MGS implique l’ablation de la rétine neurosensorielle avant la photo-documentation de la choroïde RPE. Cette étape déloge les SDD à des degrés ^divers30,31 et supprime la correspondance spatiale de la rétine externe et de son système de support. Ainsi, les efforts visant à lier la demande métabolique et la signalisation de la rétine à la pathologie de l’EPR-choroïde peuvent être entravés. Le système de l’Utah a mis en œuvre le MMI en utilisant la photographie couleur ex vivo et l’OCT pour catégoriser les yeux destinés à la dissection en régions pour les extractions d’ARN et de protéines³². Bien que préférable aux extractions d’œillets entiers, la zone de 3 mm de diamètre présentant le risque le plus élevé de progression de la DMLA^33,34 ne représente que 25% d’un poinçon centré sur la fovéa de 6 mm de diamètre. Ainsi, les techniques qui permettent de localiser les résultats en référence à la fovéa, telles que la coupe en série pour l’immunohistochimie, sont avantageuses.