Ex Vivo OCT-basierte multimodale Bildgebung menschlicher Spenderaugen zur Erforschung der altersbedingten Makuladegeneration

Fünfzehn Jahre Behandlung der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD) mit einer Anti-VEGF-Therapie unter der Leitung der optischen Kohärenztomographie (OCT) haben neue Einblicke in die Progressionssequenz und Mikroarchitektur dieser weit verbreiteten Ursache des Sehverlusts ermöglicht. Eine wichtige Erkenntnis ist, dass AMD eine dreidimensionale Erkrankung ist, die die neurosensorische Netzhaut, das retinale Pigmentepithel (RPE) und die Aderhaut betrifft. Als Ergebnis der OCT-Bildgebung von Studienpatienten und den Mitaugen der behandelten Klinikpatienten werden nun die Merkmale der Pathologie erkannt, die über die von der Farbfundusfotografie hinausgehen, die seit Jahrzehnten ein klinischer Standard ist. Dazu gehören intraretinale Neovaskularisationen (Typ 3 Makulaneovaskularisation¹, ehemals angiomatöse Proliferation), subretinale Drusenoidablagerungen (SDDs, auch retikuläre Pseudodrusen genannt)², multiple Signalwege des RPE-Schicksals^3,4 und intensiv gliotische Müllerzellen bei Atrophie ^5,6.

Modellsysteme, denen Makula (Zellen und Tiere) fehlen, bilden einige Ausschnitte dieser komplexen Krankheit nach ^7,8,9. Ein weiterer Erfolg bei der Linderung der Belastung durch AMD könnte durch die Entdeckung und Erforschung der primären Pathologie im menschlichen Auge, das Verständnis der einzigartigen zellulären Zusammensetzung der Makula und die anschließende Übertragung in Modellsysteme erzielt werden. Dieser Bericht porträtiert eine drei Jahrzehnte währende Zusammenarbeit zwischen einem akademischen Forschungslabor und einer Augenbank. Die hierin beschriebenen Gewebecharakterisierungsmethoden verfolgen zwei Ziele: 1) die sich entwickelnde diagnostische Technologie durch die Demonstration der Grundlagen des Fundusaussehens und der Bildgebungssignalquellen mit Mikroskopie zu informieren und 2) AMD-Proben für gezielte (Immunhistochemie) und ungezielte molekulare Entdeckungstechniken (bildgebende Massenspektrometrie, IMS und räumliche Transkriptomik) zu klassifizieren, die die reine Zapfenfovea und die stäbchenreiche para- und perifovea erhalten. Solche Studien könnten die Translation in die klinische OCT beschleunigen, für die eine Progressionssequenz und eine longitudinale Nachbeobachtung durch Eye-Tracking möglich sind. Diese Technologie, die zur Überwachung der Behandlungseffekte entwickelt wurde, registriert Scans von einem Klinikbesuch zum nächsten mit Hilfe von Netzhautgefäßen. Die Verknüpfung von Eye-Track-OCT mit Laborergebnissen, die mit destruktiven Techniken erzielt wurden, könnte molekularen Befunden eine neue Ebene der Prognose verleihen.

Im Jahr 1993 nahm das Forschungslabor Farbfotos des postmortalen Fundus auf Film¹⁰ auf. Inspiriert wurde diese Arbeit durch die hervorragende Photomikroskopie und Histologie der menschlichen peripheren Netzhaut von Foos und Kollegen 11,12,13 und die umfangreichen klinisch-pathologischen Korrelationen der AMD von Sarks et ^al.14,15. Ab 2009 wurde die multimodale Ex-vivo-Bildgebung (MMI) eingeführt, die auf der Spektraldomäne OCT verankert ist. Dieser Übergang wurde durch die ähnlichen Bemühungen anderer^16,17 und insbesondere durch die Erkenntnis inspiriert, dass so viel von der von den Sarks beschriebenen Ultrastruktur im Laufe der Zeit in der Klinik dreidimensional verfügbar war^18,19. Ziel war es, Augen mit anhaftenden Makulamuskeln in einem angemessenen Zeitrahmen für aussagekräftige Studien von Phänotypen auf zellulärer Ebene in Netzhaut, RPE und Aderhaut zu gewinnen. Die Absicht war, über die “Pro-Auge”-Statistik hinaus zu “pro Läsionstyp” überzugehen, einem Standard, der von den Konzepten der “anfälligen Plaque” bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflusst wird^20,21.

Das Protokoll in diesem Bericht spiegelt Erfahrungen mit fast 400 Paaren von Spenderaugen wider, die in mehreren Strömen akzessioniert wurden. In den Jahren 2011-2014 wurde die Website des Projekts MACULA zur AMD-Histopathologie erstellt, die Schichtdicken und Anmerkungen von 142 archivierten Proben enthält. Diese Augen wurden von 1996-2012 in einem Glutaraldehyd-Paraformaldehyd-Fixiermittel für hochauflösende Epoxidharz-Histologie und Elektronenmikroskopie konserviert. Alle Fundi waren bei Erhalt in Farbe fotografiert worden und wurden kurz vor der Histologie durch OCT neu abgebildet. Ein Augenhalter, der ursprünglich für die Untersuchung des Sehnervs²² konzipiert war, wurde verwendet, um eine Gewebestanze mit einem Durchmesser von 8 mm in voller Dicke aufzunehmen, die auf der Fovea zentriert war. OCT-B-Scans durch das foveale Zentrum und eine 2 mm obere Stelle, die der Histologie auf den gleichen Ebenen entspricht, wurden auf die Website hochgeladen, zusammen mit einem Farbfundusfoto. Die Wahl der OCT-Ebenen wurde durch die Prominenz der AMD-Pathologie unter der Fovea²³ und die Prominenz der SDDs in stäbchenreichen Bereichen, die der Fovea überlegen sind, diktiert^24,25.

Seit 2013 stehen Augen, die lebenslang mit OCT-verankertem MMI abgebildet wurden, für direkte klinisch-pathologische Korrelationen zur Verfügung. Bei den meisten (7 von 10 Spendern) handelte es sich um Patienten einer Netzhautüberweisungspraxis (Autor: K.B.F.), die ein Register für Patienten, die daran interessiert waren, ihre Augen nach dem Tod zu Forschungszwecken zu spenden, anbot. Die Augen wurden von der örtlichen Augenbank geborgen und konserviert, ins Labor gebracht und auf die gleiche Weise wie die Augen des Projekts MACULA präpariert. Die prämortalen klinischen OCT-Volumina wurden nahtlos im Labor gelesen, wodurch die im Laufe des Lebens beobachteten pathologischen Merkmale mit den unter dem Mikroskop sichtbaren Merkmalen in Einklang gebracht wurden²⁶.

Ab 2014 begann die prospektive Augenentnahme mit einem Screening auf AMD bei Spenderaugen ohne klinische Anamnese, die jedoch während eines definierten Zeitraums (6 h) aufbewahrt wurden. Zu diesem Zweck wurde der Augenhalter so modifiziert, dass er einen ganzen Globus aufnehmen kann. Dies verringerte die Wahrscheinlichkeit, dass sich die Schnittkanten des zuvor verwendeten 8-mm-Stempels ablösten. Die Augen wurden in 4 % gepuffertem Paraformaldehyd für die Immunhistochemie konserviert und am nächsten Tag zur Langzeitlagerung auf 1 % überführt. In den Jahren 2016-2017 (vor der Pandemie) wurden 184 Augen von 90 Spendern geborgen. Die Statistiken und Bilder in diesem Bericht stammen aus dieser Serie. Während der Pandemie-Ära (Lockdowns und Nachwirkungen 2020) wurden die prospektiven Sammlungen für Transkriptomik und IMS-Kollaborationen in reduziertem Tempo fortgesetzt, wobei im Wesentlichen die Methoden von 2014 verwendet wurden.

Andere Methoden zur Beurteilung des Spenderauges stehen zur Verfügung. Das Minnesota Grading System (MGS)^27,28 basiert auf dem klinischen AREDS-System für die Farbfundusfotografie ²⁹. Zu den Einschränkungen dieser Methode gehört die Kombination von atrophischer und neovaskulärer AMD in einem Stadium der “späten AMD”. Des Weiteren beinhaltet die MGS die Entfernung der neurosensorischen Netzhaut vor der Fotodokumentation der RPE-Aderhaut. Dieser Schritt löst SDDs in unterschiedlichem Ausmaß^30,31 und entfernt die räumliche Entsprechung der äußeren Netzhaut und ihres Stützsystems. Daher könnten die Bemühungen, den metabolischen Bedarf und die Signalübertragung von der Netzhaut mit der Pathologie in der RPE-Aderhaut in Verbindung zu bringen, behindert werden. Das Utah-System implementierte MMI unter Verwendung von Ex-vivo-Farbfotografie und OCT, um Augen, die für die Sektion bestimmt waren, in Regionen für RNA- und Proteinextraktionen zu kategorisieren³². Obwohl er der Extraktion ganzer Augenmuscheln vorzuziehen ist, macht der Bereich mit einem Durchmesser von 3 mm und dem höchsten Risiko für eine AMD-Progression^33,34 nur 25 % einer foveazentrierten Stanze mit 6 mm Durchmesser aus. Daher sind Techniken von Vorteil, die Befunde in Bezug auf die Fovea lokalisieren können, wie z. B. Reihenschnitte für die Immunhistochemie.