Microinyección dirigida y electroporación de organoides cerebrales de primates para la modificación genética
Summary
La electroporación de organoides cerebrales de primates proporciona un enfoque preciso y eficiente para introducir modificaciones genéticas transitorias en diferentes tipos de progenitores y neuronas en un sistema modelo cercano al desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex de primates. Esto permite el estudio de los procesos evolutivos y del desarrollo neurológico y también se puede aplicar para el modelado de enfermedades.
Abstract
La corteza cerebral es la estructura cerebral más externa y es responsable del procesamiento de la entrada sensorial y la salida motora; Es visto como el asiento de las capacidades cognitivas de orden superior en los mamíferos, en particular, los primates. El estudio de las funciones genéticas en los cerebros de los primates es un desafío debido a razones técnicas y éticas, pero el establecimiento de la tecnología de organoides cerebrales ha permitido el estudio del desarrollo del cerebro en modelos tradicionales de primates (por ejemplo, macaco rhesus y tití común), así como en especies de primates previamente inaccesibles experimentalmente (por ejemplo, grandes simios), en un sistema éticamente justificable y menos exigente técnicamente. Además, los organoides cerebrales humanos permiten la investigación avanzada de trastornos neurológicos y del neurodesarrollo.
A medida que los organoides cerebrales recapitulan muchos procesos del desarrollo cerebral, también representan una herramienta poderosa para identificar diferencias y comparar funcionalmente los determinantes genéticos subyacentes al desarrollo cerebral de varias especies en un contexto evolutivo. Una gran ventaja del uso de organoides es la posibilidad de introducir modificaciones genéticas, lo que permite probar las funciones de los genes. Sin embargo, la introducción de tales modificaciones es laboriosa y costosa. Este documento describe un enfoque rápido y rentable para modificar genéticamente las poblaciones celulares dentro de las estructuras ventriculares de los organoides cerebrales de primates, un subtipo de organoides cerebrales. Este método combina un protocolo modificado para la generación confiable de organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de titíes humanos, chimpancés, macacos rhesus y comunes con un enfoque de microinyección y electroporación. Esto proporciona una herramienta eficaz para el estudio de los procesos de desarrollo neurológico y evolutivo que también se puede aplicar para el modelado de enfermedades.
Introduction
Investigar el desarrollo (pato)fisiológico y la evolución de la corteza cerebral es una tarea formidable que se ve obstaculizada por la falta de sistemas modelo adecuados. Anteriormente, tales estudios se limitaban a modelos de cultivo celular bidimensionales (como progenitores neurales primarios o cultivos de células neuronales) y modelos animales evolutivamente distantes (como roedores)1,2. Si bien estos modelos son útiles para abordar ciertas preguntas, están limitados para modelar la complejidad, la composición del tipo de célula, la arquitectura celular y los patrones de expresión génica del neocórtex humano en desarrollo en estados sanos y enfermos. Estas limitaciones conducen, por ejemplo, a la escasa traducibilidad de los modelos de ratón de enfermedades humanas a la situación humana, como se describe para ciertos casos de microcefalia (por ejemplo, Zhang et al.3). Recientemente, los primates transgénicos no humanos, que son un modelo evolutivo, funcional y morfológicamente más cercano del desarrollo del neocórtex humano, se han enfocado 4,5,6,7,8 a medida que superan muchas limitaciones de los modelos basados en cultivos celulares y roedores. Sin embargo, el uso de primates no humanos en la investigación no solo es muy costoso y requiere mucho tiempo, sino que también plantea preocupaciones éticas. Más recientemente, el desarrollo de la tecnología de organoides cerebrales 9,10 ha surgido como una alternativa prometedora que resuelve muchas de las limitaciones de los modelos anteriores 11,12,13,14,15,16.
Los organoides cerebrales son estructuras tridimensionales (3D), multicelulares que emulan las características principales de la citoarquitectura y la composición de tipo celular de una o múltiples regiones cerebrales para una ventana de tiempo de desarrollo definida 11,12,13,14,17. Estas estructuras 3D se generan a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) o, si están disponibles para las especies de interés, a partir de células madre embrionarias (ESC). En general, se pueden distinguir dos tipos de organoides cerebrales con base en la metodología utilizada: organoides cerebrales no guiados y regionalizados (guiados)18. Al generar este último tipo de organoides, se proporcionan pequeñas moléculas o factores que guían la diferenciación de las células madre pluripotentes a organoides de una región particular del cerebro (por ejemplo, organoides del cerebro anterior)18. Por el contrario, en los organoides no guiados, la diferenciación no está guiada por la adición de moléculas pequeñas, sino que se basa exclusivamente en la diferenciación espontánea de las iPSCs/ESCs. Los organoides cerebrales resultantes consisten en tipos de células que representan diferentes regiones cerebrales (por ejemplo, organoides cerebrales)18. Los organoides cerebrales combinan muchas características clave del desarrollo cerebral con una generación relativamente rentable y eficiente en el tiempo a partir de cualquier especie de interés para la cual se dispone de iPSC o ESCs11,12,13,14. Esto hace que los organoides cerebrales sean un excelente modelo para muchos tipos de estudios neurobiológicos, que van desde preguntas evolutivas y de desarrollo hasta modelos de enfermedades y pruebas de drogas15,16. Sin embargo, abordar estas preguntas utilizando organoides cerebrales depende en gran medida de la disponibilidad de diferentes métodos para la modificación genética.
Un aspecto clave del estudio del desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex y su evolución es el análisis funcional de genes y variantes genéticas. Esto generalmente se logra por expresión (ectópica) y / o por knock-down (KD) o knock-out (KO) de esos genes. Tales modificaciones genéticas pueden clasificarse en modificaciones genéticas estables y transitorias, así como en modificaciones restringidas temporal y espacialmente o no restringidas. La modificación genética estable se define por la introducción de una alteración genética en el genoma del huésped que se transmite a todas las generaciones celulares posteriores. Dependiendo del punto de tiempo de la modificación genética, puede afectar a todas las células de un organoide o puede restringirse a ciertas poblaciones celulares. Con mayor frecuencia, la modificación genética estable se logra en organoides cerebrales a nivel de iPSC / ESC mediante la aplicación de lentivirus, sistemas similares a transposones y la tecnología CRISPR / Cas9 (revisada por, por ejemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 y Teriyapirom et al.20). Esto tiene la ventaja de que todas las células del organoide cerebral llevan la modificación genética y que no está restringida temporal o espacialmente. Sin embargo, la generación y caracterización de estas líneas estables iPSC/ESC lleva mucho tiempo, a menudo toma varios meses hasta que se pueden analizar los primeros organoides cerebrales modificados (revisado por, por ejemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, o Teriyapirom et al.20).
En contraste, la modificación genética transitoria se define por la entrega de carga genética (por ejemplo, un plásmido de expresión génica) que no se integra en el genoma del huésped. Si bien esta modificación puede, en principio, transmitirse a las generaciones celulares posteriores, la carga genética entregada se diluirá progresivamente con cada división celular. Por lo tanto, este tipo de modificación genética suele estar restringida temporal y espacialmente. La modificación genética transitoria puede llevarse a cabo en organoides cerebrales por virus adenoasociados o por electroporación (revisada por, por ejemplo, por Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 y Teriyapirom et al.20), siendo este último descrito en detalle en este artículo. En contraste con la modificación genética estable, este enfoque es muy rápido y rentable. De hecho, la electroporación se puede realizar en cuestión de minutos y, dependiendo de la(s) población(es) de células diana, los organoides electroporados están listos para su análisis en cuestión de días (revisados por, por ejemplo, Fischer et al.17 y Kyrousi et al.19). Sin embargo, los cambios morfológicos macroscópicos del organoide cerebral, como las diferencias de tamaño, no se pueden detectar utilizando este método, ya que este tipo de modificación genética está restringida temporal y espacialmente. Esta restricción también puede ser una ventaja, por ejemplo, en el caso de estudiar poblaciones celulares individuales dentro del organoide o los efectos sobre los organoides cerebrales en puntos de tiempo de desarrollo específicos (revisado por, por ejemplo, Fischer et al.17 y Kyrousi et al.19).
Un enfoque clásico para estudiar la función de los genes durante el desarrollo y la evolución del cerebro es la electroporación in utero. La electroporación in utero es una técnica bien conocida y útil para la entrega de construcciones de expresión génica en cerebros de roedores 21,22,23 y hurones24,25. Primero, una solución que contiene la(s) construcción(es) de expresión de interés se microinyecta a través de la pared uterina en un determinado ventrículo del cerebro embrionario, dependiendo de la región a la que se dirija. En el segundo paso, se aplican pulsos eléctricos para transfectar las células que recubren directamente el ventrículo objetivo. Este enfoque no sólo se limita a la expresión ectópica o la sobreexpresión de genes, sino que también puede aplicarse en estudios de KD o KO mediante microinyección de horquilla corta (shRNA) o CRISPR/Cas9 (en forma de plásmidos de expresión o ribonucleoproteínas [RNPs]), respectivamente26,27. Sin embargo, la electroporación in utero de embriones de ratón, rata y hurón tiene las mismas limitaciones que se describieron anteriormente para estos modelos animales.
Idealmente, a uno le gustaría realizar electroporación in utero directamente en primates. Si bien esto es, en principio, técnicamente posible, la electroporación in utero no se lleva a cabo en primates debido a preocupaciones éticas, altos costos de mantenimiento de los animales y pequeños tamaños de camada. Para ciertos primates, como los grandes simios (incluidos los humanos), esto no es posible en absoluto. Sin embargo, estos primates tienen el mayor potencial para el estudio del desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex humano y su evolución. Una solución a este dilema es aplicar la técnica de electroporación a organoides cerebrales de primates28.
Este artículo presenta un protocolo para la electroporación de un subtipo de organoides cerebrales de primates, los organoides cerebrales de primates. Este enfoque permite la modificación genética rápida y rentable de las poblaciones celulares dentro de las estructuras similares a ventrículos de los organoides. Específicamente, describimos un protocolo unificado para la generación de organoides cerebrales de primates a partir de iPSC humanas (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes), macacos rhesus (Macaca mulatta) y tití común (Callithrix jacchus). Además, describimos la técnica de microinyección y electroporación en detalle y proporcionamos criterios de “ir” y “no ir” para realizar la electroporación de organoides cerebrales de primates. Este enfoque es una herramienta eficaz para estudiar el desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex y su evolución en un modelo especialmente cercano a la situación humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los procedimientos descritos aquí representan un protocolo unificado para la generación de organoides cerebrales de diferentes especies de primates con un enfoque de electroporación dirigido. Esto permite la expresión ectópica de un GOI en un sistema modelo que emula el desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex de los primates (incluido el humano). Este protocolo unificado para la generación de organoides cerebrales de primates utiliza los mismos materiales (por ejemplo, medios) y pasos de protocolo para las cua…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pedimos disculpas a todos los investigadores cuyo trabajo no pudo ser citado debido a limitaciones de espacio. Agradecemos a Ulrich Bleyer de los servicios técnicos de DPZ y a Hartmut Wolf del taller de MPI-CBG por la construcción de las cámaras de electrodos de la placa de Petri; Stoyan Petkov y Rüdiger Behr por proporcionar iPSC humanas (iLonza2.2), macacos rhesus (iRh33.1) y titíes (cj_160419_5); Sabrina Heide para la criosección y tinción por inmunofluorescencia; y Neringa Liutikaite y César Mateo Bastidas Betancourt por la lectura crítica del manuscrito. El trabajo en el laboratorio de W.B.H. fue apoyado por una subvención de ERA-NET NEURON (MicroKin). El trabajo en el laboratorio de M.H. fue apoyado por una subvención inicial del ERC (101039421).
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
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