Таргетная микроинъекция и электропорация церебральных органоидов приматов для генетической модификации

Исследование (пато)физиологического развития и эволюции коры головного мозга является сложной задачей, которая затрудняется отсутствием подходящих модельных систем. Ранее такие исследования ограничивались двумерными моделями клеточных культур (таких как первичный нейронный предшественник или культуры нейрональных клеток) и эволюционно удаленными моделями животных (таких как грызуны)^1,2. Хотя эти модели полезны для решения определенных вопросов, они ограничены в моделировании сложности, состава типа клеток, клеточной архитектуры и паттернов экспрессии генов развивающегося неокортекса человека в здоровом и болезненном состояниях. Эти ограничения приводят, например, к плохой переводимости мышиных моделей заболеваний человека на ситуацию человека, как описано для некоторых случаев микроцефалии (например, Zhang et ^al.3). В последнее время трансгенные нечеловекообразные приматы, которые являются эволюционно, функционально и морфологически более близкой моделью развития неокортекса человека, оказались в центре внимания 4,5,6,7,8, поскольку они преодолевают многие ограничения моделей^, основанных на клеточных культурах и грызунах. Тем не менее, использование нечеловеческих приматов в исследованиях не только очень дорого и отнимает много времени, но и вызывает этические проблемы. Совсем недавно развитие технологии органоидов мозга 9,10 стало многообещающей альтернативой, которая решает многие ограничения предыдущих моделей 11,12,13,14,15,16.

Органоиды мозга представляют собой трехмерные (3D) многоклеточные структуры, которые имитируют основные особенности цитоархитектинации и клеточного состава одной или нескольких областей мозга для определенного временного окна развития 11,12,13,14,17. Эти 3D-структуры генерируются либо из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), либо, если они доступны для интересующих видов, из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). В целом, на основе используемой методологии можно выделить два типа органоидов мозга: неуправляемые и регионализованные (управляемые) органоиды мозга¹⁸. При создании последнего типа органоидов предусмотрены небольшие молекулы или факторы, которые направляют дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в органоиды определенной области мозга (например, органоиды переднего мозга)¹⁸. Напротив, в неуправляемых органоидах дифференциация не определяется добавлением малых молекул, а скорее опирается исключительно на спонтанную дифференцировку ИПСК/ЭСК. Полученные органоиды мозга состоят из типов клеток, представляющих различные области мозга (например, церебральные органоиды)¹⁸. Органоиды мозга сочетают в себе многие ключевые особенности развития мозга с относительно экономичной и эффективной по времени генерацией из любых видов, представляющих интерес, для которых доступны ИПСК или ЭСК^11,12,13,14. Это делает органоиды мозга отличной моделью для многих видов нейробиологических исследований, начиная от вопросов эволюции и развития и заканчивая моделированием заболеваний и тестированием лекарств^15,16. Однако решение таких вопросов с помощью органоидов мозга сильно зависит от наличия различных методов генетической модификации.

Одним из ключевых аспектов изучения неокортекса (пато)физиологического развития и его эволюции является функциональный анализ генов и вариантов генов. Обычно это достигается путем (эктопической) экспрессии и/или нокдауна (KD) или нокаута (KO) этих генов. Такие генетические модификации могут быть классифицированы как стабильные и преходящие генетические модификации, а также модификации, ограниченные или не ограниченные во времени и пространстве. Стабильная генетическая модификация определяется введением генетического изменения в геном хозяина, которое передается всем последующим поколениям клеток. В зависимости от момента генетической модификации он может влиять на все клетки органоида или может быть ограничен определенными клеточными популяциями. Чаще всего стабильная генетическая модификация достигается в органоидах мозга на уровне iPSC/ESC путем применения лентивирусов, транспозоноподобных систем и технологии CRISPR/Cas9 (рассмотрено, например, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 и Teriyapirom et ^al.20). Это имеет то преимущество, что все клетки органоида мозга несут генетическую модификацию и что она не ограничена ни во времени, ни в пространстве. Однако генерация и характеристика этих стабильных линий iPSC/ESC занимает очень много времени, часто занимая несколько месяцев, прежде чем можно будет проанализировать первые модифицированные органоиды мозга (рассмотренные, например, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 или Teriyapirom et ^al.20).

Напротив, преходящая генетическая модификация определяется доставкой генетического груза (например, плазмиды экспрессии генов), которая не интегрируется в геном хозяина. Хотя эта модификация в принципе может быть передана последующим поколениям клеток, доставленный генетический груз будет постепенно разбавляться с каждым делением клетки. Поэтому этот тип генетической модификации обычно ограничен во времени и пространстве. Преходящая генетическая модификация может осуществляться в органоидах мозга аденоассоциированными вирусами или электропорацией (рассмотрено, например, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 и Teriyapirom et ^al.20), причем последнее подробно описано в этой статье. В отличие от стабильной генетической модификации, этот подход очень быстрый и экономически эффективный. Действительно, электропорация может быть выполнена в течение нескольких минут, и, в зависимости от популяции клеток-мишеней, электропорированные органоиды готовы к анализу в течение нескольких дней (рассмотрено, например, Fischer et al.17 и Kyrousi et ^al.19). Однако грубые морфологические изменения органоида мозга, такие как различия в размерах, не могут быть обнаружены с помощью этого метода, поскольку этот тип генетической модификации ограничен во времени и пространстве. Это ограничение также может быть преимуществом, например, в случае изучения отдельных клеточных популяций внутри органоида или воздействия на органоиды мозга в определенные моменты времени развития (рассмотрено, например, Fischer et al.17 и Kyrousi et ^al.19).

Классический подход к изучению функции генов во время развития и эволюции мозга заключается в внутриутробной электропорации. Внутриутробная электропорация является хорошо известным и полезным методом доставки конструкций экспрессии генов в мозг грызунов 21,22,23 и хорька ^24,25. Во-первых, раствор, содержащий интересующую конструкцию (конструкции) экспрессии, микроинъецируют через стенку матки в определенный желудочек эмбрионального мозга, в зависимости от области, на которую будет нацелена. На втором этапе электрические импульсы применяются для трансфицирования клеток, непосредственно выстилающих целевой желудочек. Этот подход не ограничивается только эктопической экспрессией или сверхэкспрессией генов, поскольку он также может быть применен в исследованиях KD или KO путем микроинъекции короткой шпильки (шРНК) или CRISPR/Cas9 (в виде экспрессионных плазмид или рибонуклеопротеинов [RNP]) соответственно^26,27. Однако внутриутробная электропорация эмбрионов мышей, крыс и хорьков имеет те же ограничения, что и описанные выше для этих животных моделей.

В идеале хотелось бы проводить внутриутробную электропорацию непосредственно у приматов. Хотя это, в принципе, технически возможно, внутриутробно электропорация у приматов не проводится из-за этических соображений, высоких затрат на содержание животных и небольших размеров помета. Для некоторых приматов, таких как человекообразные обезьяны (включая людей), это вообще невозможно. Однако эти приматы обладают наибольшим потенциалом для изучения (пато)физиологического развития неокортекса человека и его эволюции. Одним из решений этой дилеммы является применение метода электропорации к органоидам мозга приматов²⁸.

В данной работе представлен протокол электропорации подтипа органоидов мозга приматов, церебральных органоидов приматов. Этот подход позволяет быстро и экономически эффективно генетическую модификацию клеточных популяций в желудочкоподобных структурах органоидов. В частности, мы описываем унифицированный протокол генерации церебральных органоидов приматов из ИПСК человека (Homo sapiens), шимпанзе (Pan troglodytes), макак-резуса (Macaca mulatta) и обыкновенной мартышки (Callithrix jacchus). Кроме того, мы подробно описываем технику микроинъекций и электропорации и предоставляем критерии «идти» и «нет» для выполнения электропорации органоидов головного мозга приматов. Этот подход является эффективным инструментом для изучения (пато)физиологического развития неокортекса и его эволюции в модели, особенно близкой к человеческой ситуации.