الحقن المجهري المستهدف والتثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية الرئيسية للتعديل الوراثي
Summary
يوفر التثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية للرئيسيات نهجا دقيقا وفعالا لإدخال تعديل (تعديلات) وراثية عابرة في أنواع مختلفة من السلف والخلايا العصبية في نظام نموذجي قريب من تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية للرئيسيات (المرضية). هذا يسمح بدراسة العمليات العصبية النمائية والتطورية ويمكن أيضا تطبيقه على نمذجة المرض.
Abstract
القشرة الدماغية هي بنية الدماغ الخارجية وهي مسؤولة عن معالجة المدخلات الحسية والمخرجات الحركية. ينظر إليه على أنه مقر القدرات المعرفية العليا في الثدييات ، على وجه الخصوص ، الرئيسيات. تعد دراسة وظائف الجينات في أدمغة الرئيسيات أمرا صعبا لأسباب تقنية وأخلاقية ، لكن إنشاء تقنية العضو العضوي في الدماغ مكن من دراسة نمو الدماغ في نماذج الرئيسيات التقليدية (على سبيل المثال ، المكاك الريسوس والمارموسيت الشائع) ، وكذلك في أنواع الرئيسيات التي كان يتعذر الوصول إليها تجريبيا (على سبيل المثال ، القردة العليا) ، في نظام مبرر أخلاقيا وأقل تطلبا من الناحية الفنية. علاوة على ذلك ، تسمح عضويات الدماغ البشري بالتحقيق المتقدم في الاضطرابات العصبية النمائية والعصبية.
نظرا لأن عضويات الدماغ تلخص العديد من عمليات نمو الدماغ ، فإنها تمثل أيضا أداة قوية لتحديد الاختلافات في المحددات الجينية الكامنة وراء نمو الدماغ لمختلف الأنواع في سياق تطوري ومقارنتها وظيفيا. ميزة كبيرة لاستخدام المواد العضوية هي إمكانية إدخال تعديلات وراثية ، مما يسمح باختبار وظائف الجينات. ومع ذلك ، فإن إدخال مثل هذه التعديلات أمر شاق ومكلف. تصف هذه الورقة نهجا سريعا وفعالا من حيث التكلفة لتعديل مجموعات الخلايا وراثيا داخل الهياكل الشبيهة بالبطين للعضويات الدماغية الرئيسية ، وهي نوع فرعي من عضويات الدماغ. تجمع هذه الطريقة بين بروتوكول معدل للتوليد الموثوق به من العضويات الدماغية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الإنسان والشمبانزي المكاك الريسوس والخلايا الجذعية المستحثة المشتقة من المارموسيت (iPSCs) مع نهج الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي. يوفر هذا أداة فعالة لدراسة العمليات العصبية النمائية والتطورية التي يمكن تطبيقها أيضا لنمذجة المرض.
Introduction
يعد التحقيق في التطور الفسيولوجي (المرضي) وتطور القشرة الدماغية مهمة هائلة يعوقها عدم وجود أنظمة نموذجية مناسبة. في السابق ، كانت هذه الدراسات تقتصر على نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (مثل السلف العصبي الأولي أو مزارع الخلايا العصبية) والنماذج الحيوانية البعيدة تطوريا (مثل القوارض)1,2. في حين أن هذه النماذج مفيدة لمعالجة بعض الأسئلة ، إلا أنها محدودة في نمذجة التعقيد ، وتكوين نوع الخلية ، والبنية الخلوية ، وأنماط التعبير الجيني للقشرة المخية البشرية النامية في الحالات الصحية والمريضة. وتؤدي هذه القيود، على سبيل المثال، إلى ضعف قابلية ترجمة نماذج الفئران للأمراض البشرية إلى الحالة البشرية، كما هو موصوف بالنسبة لحالات معينة من صغر الرأس (على سبيل المثال، Zhang et al.3). في الآونة الأخيرة ، أصبحت الرئيسيات غير البشرية المعدلة وراثيا ، والتي تعد نموذجا أقرب تطوريا ووظيفيا ومورفولوجيا لتطور القشرة المخية الحديثة البشرية ، موضع تركيز4،5،6،7،8 لأنها تتغلب على العديد من قيود زراعة الخلايا والنماذج القائمة على القوارض. ومع ذلك ، فإن استخدام الرئيسيات غير البشرية في البحث ليس مكلفا للغاية ويستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل يثير أيضا مخاوف أخلاقية. في الآونة الأخيرة ، ظهر تطوير تقنية الدماغ العضوية 9,10 كبديل واعد يحل العديد من قيود النماذج السابقة 11،12،13،14،15،16.
عضويات الدماغ هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) ، متعددة الخلايا تحاكي السمات الرئيسية للهندسة الخلوية وتكوين نوع الخلية لمنطقة واحدة أو عدة مناطق دماغية لنافذة زمنية تنموية محددة11،12،13،14،17. يتم إنشاء هذه الهياكل 3D إما من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) أو ، إذا كانت متاحة للأنواع ذات الاهتمام ، من الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs). بشكل عام ، يمكن التمييز بين نوعين من عضويات الدماغ بناء على المنهجية المستخدمة: عضويات الدماغ غير الموجهة والإقليمية (الموجهة)18. عند توليد النوع الأخير من الكائنات العضوية ، يتم توفير جزيئات أو عوامل صغيرة توجه تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى عضويات في منطقة معينة من الدماغ (على سبيل المثال ، عضويات الدماغ الأمامي)18. على النقيض من ذلك ، في الكائنات العضوية غير الموجهة ، لا يسترشد التمايز بإضافة جزيئات صغيرة ولكنه يعتمد حصريا على التمايز التلقائي ل iPSCs / ESCs. تتكون عضويات الدماغ الناتجة من أنواع الخلايا التي تمثل مناطق مختلفة من الدماغ (على سبيل المثال ، عضويات دماغية)18. تجمع عضويات الدماغ بين العديد من السمات الرئيسية لنمو الدماغ مع توليد فعال نسبيا من حيث التكلفة والوقت من أي نوع من أنواع الاهتمام التي تتوفر لها iPSCs أو ESCs11،12،13،14. هذا يجعل عضويات الدماغ نموذجا ممتازا للعديد من أنواع الدراسات البيولوجية العصبية ، بدءا من الأسئلة التطورية والتنموية إلى نمذجة الأمراض واختبار الأدوية15,16. ومع ذلك ، فإن معالجة مثل هذه الأسئلة باستخدام عضويات الدماغ تعتمد بشدة على توافر طرق مختلفة للتعديل الوراثي.
أحد الجوانب الرئيسية لدراسة التطور الفسيولوجي للقشرة المخية الحديثة (المرضية) وتطورها هو التحليل الوظيفي للجينات ومتغيرات الجينات. يتم تحقيق ذلك عادة عن طريق التعبير (خارج الرحم) و / أو عن طريق الضربة القاضية (KD) أو الضربة القاضية (KO) لتلك الجينات. ويمكن تصنيف هذه التعديلات الجينية إلى تعديل وراثي مستقر وعابر، وكذلك إلى تعديلات مقيدة زمانيا ومكانيا أو غير مقيدة. يتم تعريف التعديل الوراثي المستقر من خلال إدخال تغيير جيني في جينوم المضيف ينتقل إلى جميع أجيال الخلايا اللاحقة. اعتمادا على النقطة الزمنية للتعديل الوراثي ، يمكن أن يؤثر على جميع خلايا العضو أو يمكن أن يقتصر على مجموعات خلايا معينة. في أغلب الأحيان ، يتم تحقيق تعديل وراثي مستقر في عضويات الدماغ على مستوى iPSC / ESC من خلال تطبيق الفيروسات العدسية ، والأنظمة الشبيهة بالترانسبوزون ، وتقنية CRISPR / Cas9 (تمت مراجعتها من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et al.19 و Teriyapirom et al.20). هذا له ميزة أن جميع خلايا الدماغ العضو تحمل التعديل الجيني وأنه غير مقيد زمانيا أو مكانيا. ومع ذلك ، فإن توليد وتوصيف خطوط iPSC / ESC المستقرة هذه يستغرق وقتا طويلا للغاية ، وغالبا ما يستغرق عدة أشهر حتى يمكن تحليل أول عضويات دماغية معدلة (تمت مراجعته بواسطة Fischer et al.17 أو Kyrousi et al.19 أو Teriyapirom et al.20).
في المقابل ، يتم تعريف التعديل الجيني العابر من خلال توصيل البضائع الجينية (على سبيل المثال ، بلازميد التعبير الجيني) الذي لا يندمج في جينوم المضيف. في حين أن هذا التعديل يمكن ، من حيث المبدأ ، أن ينتقل إلى أجيال الخلايا اللاحقة ، فإن الشحنة الجينية المسلمة سيتم تخفيفها تدريجيا مع كل انقسام خلوي. لذلك ، عادة ما يكون هذا النوع من التعديل الوراثي مقيدا زمانيا ومكانيا. يمكن إجراء التعديل الوراثي العابر في عضويات الدماغ عن طريق الفيروسات المرتبطة بالغدي أو عن طريق التثقيب الكهربائي (تمت مراجعته من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et al.19 و Teriyapirom et al.20) ، مع وصف الأخير بالتفصيل في هذه المقالة. على عكس التعديل الوراثي المستقر ، فإن هذا النهج سريع للغاية وفعال من حيث التكلفة. في الواقع ، يمكن إجراء التثقيب الكهربائي في غضون دقائق ، واعتمادا على مجموعة (مجموعات) الخلايا المستهدفة ، تكون الكائنات العضوية الكهربائية جاهزة للتحليل في غضون أيام (تمت مراجعتها من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et al.19). ومع ذلك ، لا يمكن اكتشاف التغيرات المورفولوجية الإجمالية للعضو في الدماغ ، مثل الاختلافات في الحجم ، باستخدام هذه الطريقة ، لأن هذا النوع من التعديل الوراثي مقيد زمانيا ومكانيا. يمكن أن يكون هذا التقييد أيضا ميزة ، على سبيل المثال ، في حالة دراسة مجموعات الخلايا الفردية داخل العضو العضوي أو التأثيرات على عضويات الدماغ في نقاط زمنية محددة للنمو (تمت مراجعته من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et al.19).
النهج الكلاسيكي لدراسة وظيفة الجينات أثناء نمو الدماغ وتطوره هو في التثقيب الكهربائي للرحم. في الرحم التثقيب الكهربائي هو تقنية معروفة ومفيدة لتوصيل تركيبات التعبير الجيني إلى القوارض 21،22،23 والنمس24،25 أدمغة. أولا ، يتم حقن محلول يحتوي على بنية (تصانيب) التعبير ذات الأهمية من خلال جدار الرحم في بطين معين من الدماغ الجنيني ، اعتمادا على المنطقة المراد استهدافها. في الخطوة الثانية ، يتم تطبيق نبضات كهربائية لنقل الخلايا المبطنة مباشرة للبطين المستهدف. لا يقتصر هذا النهج فقط على التعبير خارج الرحم أو الإفراط في التعبير عن الجينات ، حيث يمكن تطبيقه أيضا في دراسات KD أو KO عن طريق الحقن الدقيق لدبوس الشعر القصير (shRNA) أو CRISPR / Cas9 (في شكل بلازميدات التعبير أو البروتينات النووية الريبية [RNPs]) ، على التوالي26,27. ومع ذلك ، فإن التثقيب الكهربائي في الرحم لأجنة الفئران والجرذان والنمس له نفس القيود الموضحة أعلاه لهذه النماذج الحيوانية.
من الناحية المثالية ، يود المرء أن يؤدي في التثقيب الكهربائي للرحم مباشرة في الرئيسيات. في حين أن هذا ، من حيث المبدأ ، ممكن تقنيا ، إلا أن التثقيب الكهربائي في الرحم لا يتم في الرئيسيات بسبب المخاوف الأخلاقية ، وارتفاع تكاليف صيانة الحيوانات ، وأحجام القمامة الصغيرة. بالنسبة لبعض الرئيسيات ، مثل القردة العليا (بما في ذلك البشر) ، هذا غير ممكن على الإطلاق. ومع ذلك ، فإن هذه الرئيسيات لديها أكبر إمكانات لدراسة تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية البشرية (المرضية) وتطورها. أحد الحلول لهذه المعضلة هو تطبيق تقنية التثقيب الكهربائي على عضويات الدماغالرئيسية 28.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتثقيب الكهربائي لنوع فرعي من عضويات دماغ الرئيسيات ، وهي عضويات دماغية الرئيسيات. يسمح هذا النهج بالتعديل الوراثي السريع والفعال من حيث التكلفة لمجموعات الخلايا داخل الهياكل الشبيهة بالبطين للعضويات. على وجه التحديد ، وصفنا بروتوكولا موحدا لتوليد عضويات دماغية من الإنسان (الإنسان العاقل) ، والشمبانزي (Pan troglodytes) ، المكاك الريسوس (Macaca mulatta) ، والمارموسيت الشائع (Callithrix jacchus) iPSCs. علاوة على ذلك ، نصف تقنية الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي بالتفصيل ونقدم معايير “go” و “no-go” لأداء التثقيب الكهربائي العضوي الدماغي الرئيسي. هذا النهج هو أداة فعالة لدراسة (المرض) تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية وتطورها في نموذج قريب بشكل خاص من الوضع البشري.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمثل الإجراءات الموصوفة هنا بروتوكولا موحدا لتوليد عضويات دماغية من أنواع رئيسية مختلفة مع نهج التثقيب الكهربائي المستهدف. وهذا يسمح بالتعبير خارج الرحم لحكومة إسرائيل في نظام نموذجي يحاكي تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية للرئيسيات (بما في ذلك الإنسان) (المرضي). يستخدم هذا البروتو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعتذر لجميع الباحثين الذين لم يتم الاستشهاد بعملهم بسبب ضيق المساحة. نشكر أولريش بليير من الخدمات الفنية في DPZ وهارتموت وولف من ورشة العمل في MPI-CBG لبناء غرف قطب طبق بتري ؛ Stoyan Petkov و Rüdiger Behr لتوفير الإنسان (iLonza2.2) ، المكاك ريسوس (iRh33.1) و marmoset (cj_160419_5) iPSCs ؛ سابرينا هايد للتشريح بالتبريد وتلطيخ المناعة ؛ ونيرينغا ليوتيكايت وسيزار ماتيو باستيداس بيتانكورت لقراءتهما النقدية للمخطوطة. تم دعم العمل في مختبر WBH من خلال منحة ERA-NET NEURON (MICROKin). تم دعم العمل في مختبر M.H. من خلال منحة بدء ERC (101039421).
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -. K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
