Microinjection ciblée et électroporation d’organoïdes cérébraux de primates pour la modification génétique

Étudier le développement (physio)physiologique et l’évolution du cortex cérébral est une tâche formidable qui est entravée par le manque de systèmes modèles appropriés. Auparavant, ces études se limitaient à des modèles de culture cellulaire bidimensionnelle (tels que les cultures de cellules neuronales primaires ou neuronales) et à des modèles animaux distants de l’évolution (tels que les rongeurs)^1,2. Bien que ces modèles soient utiles pour répondre à certaines questions, ils sont limités dans la modélisation de la complexité, de la composition du type cellulaire, de l’architecture cellulaire et des modèles d’expression génique du néocortex humain en développement dans des états sains et malades. Ces limitations conduisent, par exemple, à la faible transposabilité des modèles murins de maladies humaines à la situation humaine, comme décrit pour certains cas de microcéphalie (par exemple, Zhang et ^al.3). Récemment, les primates transgéniques non humains, qui sont un modèle évolutif, fonctionnel et morphologiquement plus proche du développement du néocortex humain, ont attiré l’attention 4,5,6,7,8 alors qu’ils surmontent de nombreuses limitations des modèles basés sur la culture cellulaire et les rongeurs. Cependant, l’utilisation de primates non humains dans la recherche est non seulement très coûteuse et prend beaucoup de temps, mais soulève également des préoccupations éthiques. Plus récemment, le développement de la technologie des organoïdes cérébraux 9,10 est apparu comme une alternative prometteuse qui résout bon nombre des limitations des modèles précédents 11,12,13,14,15,16.

Les organoïdes cérébraux sont des structures multicellulaires tridimensionnelles (3D) qui émulent les principales caractéristiques de la cytoarchitecture et de la composition de type cellulaire d’une ou de plusieurs régions du cerveau pendant une fenêtre temporelle de développement définie 11,12,13,14,17. Ces structures 3D sont générées soit à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ou, si elles sont disponibles pour l’espèce d’intérêt, à partir de cellules souches embryonnaires (CSE). En général, deux types d’organoïdes cérébraux peuvent être distingués en fonction de la méthodologie utilisée: les organoïdes cérébraux non guidés et régionalisés (guidés)¹⁸. Lors de la génération de ce dernier type d’organoïdes, de petites molécules ou facteurs sont fournis qui guident la différenciation des cellules souches pluripotentes en organoïdes d’une région particulière du cerveau (par exemple, les organoïdes du cerveau antérieur)¹⁸. En revanche, chez les organoïdes non guidés, la différenciation n’est pas guidée par l’addition de petites molécules, mais repose exclusivement sur la différenciation spontanée des CSPi/ESC. Les organoïdes cérébraux qui en résultent sont constitués de types de cellules représentant différentes régions du cerveau (p. ex., les organoïdes cérébraux)¹⁸. Les organoïdes cérébraux combinent de nombreuses caractéristiques clés du développement du cerveau avec une génération relativement rentable et rapide à partir de toute espèce d’intérêt pour laquelle des CSPi ou des CSE sont disponibles^11,12,13,14. Cela fait des organoïdes cérébraux un excellent modèle pour de nombreux types d’études neurobiologiques, allant des questions évolutives et développementales à la modélisation des maladies et aux tests de médicaments^15,16. Cependant, la résolution de ces questions à l’aide d’organoïdes cérébraux dépend fortement de la disponibilité de différentes méthodes de modification génétique.

Un aspect clé de l’étude du développement (physio)physiologique du néocortex et de son évolution est l’analyse fonctionnelle des gènes et des variantes génétiques. Ceci est généralement réalisé par expression (ectopique) et / ou par knock-down (KD) ou knock-out (KO) de ces gènes. Ces modifications génétiques peuvent être classées en modifications génétiques stables et transitoires, ainsi qu’en modifications limitées temporellement et spatialement ou non restreintes. La modification génétique stable est définie par l’introduction d’une altération génétique dans le génome de l’hôte qui est transmise à toutes les générations cellulaires ultérieures. Selon le moment de la modification génétique, elle peut affecter toutes les cellules d’un organoïde ou peut être limitée à certaines populations cellulaires. Le plus souvent, une modification génétique stable est obtenue dans les organoïdes cérébraux au niveau iPSC/ESC en appliquant des lentivirus, des systèmes de type transposon et la technologie CRISPR/Cas9 (examinée par, par exemple, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19, et Teriyapirom et ^al.20). Cela a l’avantage que toutes les cellules de l’organoïde cérébral portent la modification génétique et qu’elle n’est pas restreinte dans le temps ou dans l’espace. Cependant, la génération et la caractérisation de ces lignées stables d’iPSC/ESC prennent beaucoup de temps, prenant souvent plusieurs mois avant que les premiers organoïdes cérébraux modifiés puissent être analysés (examinés par exemple par Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19, ou Teriyapirom et ^al.20).

En revanche, la modification génétique transitoire est définie par la livraison d’une cargaison génétique (p. ex., un plasmide d’expression génique) qui ne s’intègre pas dans le génome de l’hôte. Bien que cette modification puisse, en principe, être transmise aux générations cellulaires suivantes, la cargaison génétique délivrée sera progressivement diluée à chaque division cellulaire. Par conséquent, ce type de modification génétique est généralement limité dans le temps et dans l’espace. La modification génétique transitoire peut être effectuée dans les organoïdes cérébraux par des virus adéno-associés ou par électroporation (examinés par, par exemple, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 et Teriyapirom et ^al.20), ces derniers étant décrits en détail dans cet article. Contrairement à la modification génétique stable, cette approche est très rapide et rentable. En effet, l’électroporation peut être effectuée en quelques minutes et, selon la ou les populations de cellules cibles, les organoïdes électroporés sont prêts à être analysés en quelques jours (examinés par, par exemple, Fischer et al.17 et Kyrousi et ^al.19). Cependant, les changements morphologiques bruts de l’organoïde cérébral, tels que les différences de taille, ne peuvent pas être détectés à l’aide de cette méthode, car ce type de modification génétique est limité dans le temps et dans l’espace. Cette restriction peut également être un avantage, par exemple, dans le cas de l’étude de populations cellulaires individuelles au sein de l’organoïde ou des effets sur les organoïdes cérébraux à des moments précis du développement (examinés par, par exemple, Fischer et al.17 et Kyrousi et ^al.19).

Une approche classique pour étudier la fonction des gènes au cours du développement et de l’évolution du cerveau est l’électroporation in utero. L’électroporation in utero est une technique bien connue et utile pour l’administration de constructions d’expression génique dans les cerveaux des rongeurs 21,22,23 et des furets^24,25. Tout d’abord, une solution contenant la ou les constructions d’expression d’intérêt est microinjectée à travers la paroi utérine dans un certain ventricule du cerveau embryonnaire, en fonction de la région à cibler. Dans la deuxième étape, des impulsions électriques sont appliquées pour transfecter les cellules qui tapissent directement le ventricule ciblé. Cette approche ne se limite pas seulement à l’expression ectopique ou à la surexpression des gènes, car elle peut également être appliquée dans les études KD ou KO par micro-injection d’épingle à cheveux courte (shRNA) ou de CRISPR/Cas9 (sous forme de plasmides d’expression ou de ribonucléoprotéines [RNP]), respectivement^26,27. Cependant, l’électroporation in utero d’embryons de souris, de rats et de furets présente les mêmes limites que celles décrites ci-dessus pour ces modèles animaux.

Idéalement, on aimerait effectuer une électroporation in utero directement chez les primates. Bien que cela soit, en principe, techniquement possible, l’électroporation in utero n’est pas effectuée chez les primates en raison de préoccupations éthiques, de coûts élevés d’entretien des animaux et de la petite taille des portées. Pour certains primates, comme les grands singes (y compris les humains), ce n’est pas possible du tout. Cependant, ces primates ont le plus grand potentiel pour l’étude du développement du néocortex humain (physionomique) physiologique et de son évolution. Une solution à ce dilemme est d’appliquer la technique d’électroporation aux organoïdes cérébraux des primates²⁸.

Cet article présente un protocole pour l’électroporation d’un sous-type d’organoïdes cérébraux de primates, les organoïdes cérébraux des primates. Cette approche permet la modification génétique rapide et rentable des populations cellulaires dans les structures ventriculaires des organoïdes. Plus précisément, nous décrivons un protocole unifié pour la génération d’organoïdes cérébraux de primates à partir d’iPSC humains (Homo sapiens), de chimpanzés (Pan troglodytes), de macaques rhésus (Macaca mulatta) et de ouistiti commun (Callithrix jacchus). De plus, nous décrivons en détail la technique de micro-injection et d’électroporation et fournissons des critères « go » et « no-go » pour effectuer l’électroporation organoïde cérébrale des primates. Cette approche est un outil efficace pour étudier le développement (physionomophysiologique) du néocortex et son évolution dans un modèle particulièrement proche de la situation humaine.