霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション
Summary
霊長類の大脳オルガノイドのエレクトロポレーションは、霊長類(病原)生理学的新皮質の発生に近いモデルシステムにおいて、異なる前駆細胞タイプおよびニューロンに一過性の遺伝子改変を導入するための正確かつ効率的なアプローチを提供します。これにより、神経発達および進化過程の研究が可能になり、疾患モデリングにも適用できます。
Abstract
大脳皮質は最も外側の脳構造であり、感覚入力と運動出力の処理に関与しています。それは哺乳類、特に霊長類の高次認知能力の座と見なされています。霊長類の脳における遺伝子機能の研究は、技術的および倫理的な理由から困難ですが、脳オルガノイド技術の確立により、従来の霊長類モデル(アカゲザルやコモンマーモセットなど)や、以前は実験的にアクセスできなかった霊長類種(大型類人猿など)での脳発生の研究が可能になりました。さらに、ヒトの脳オルガノイドは、神経発達および神経障害の高度な研究を可能にします。
脳オルガノイドは、脳の発達の多くの過程を再現しているため、進化の文脈でさまざまな種の脳の発達の根底にある遺伝的決定要因の違いを特定し、機能的に比較するための強力なツールでもあります。オルガノイドを使用する大きな利点は、遺伝子機能の試験を可能にする遺伝子改変を導入する可能性である。しかしながら、そのような修正の導入は面倒で費用がかかる。この論文では、脳オルガノイドのサブタイプである霊長類大脳オルガノイドの心室様構造内の細胞集団を遺伝子組み換えするための迅速で費用効果の高いアプローチについて説明します。この方法は、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、および一般的なマーモセット由来の人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを確実に生成するための修正プロトコルと、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションアプローチを組み合わせたものです。これは、疾患モデリングにも適用できる神経発達および進化過程の研究のための効果的なツールを提供します。
Introduction
大脳皮質の(病的)生理学的発達と進化を調査することは、適切なモデルシステムの欠如によって妨げられている手ごわい仕事です。以前は、このような研究は、二次元細胞培養モデル(初代神経前駆細胞や神経細胞培養など)と進化的に遠い動物モデル(げっ歯類など)に限定されていました1,2。これらのモデルは特定の問題に対処するのに役立ちますが、健康な状態と病気の状態で発達中のヒト新皮質の複雑さ、細胞タイプの組成、細胞構造、および遺伝子発現パターンのモデリングには制限があります。これらの制限は、例えば、小頭症の特定の症例について記載されているように、ヒト疾患のマウスモデルのヒト状況への翻訳可能性の低さにつながる(例えば、Zhangら3)。最近、ヒト新皮質発生の進化的、機能的、形態学的に近いモデルであるトランスジェニック非ヒト霊長類が、細胞培養およびげっ歯類ベースのモデルの多くの制限を克服するにつれて、焦点が当てられています4,5,6,7,8。しかし、研究におけるヒト以外の霊長類の使用は、非常に費用と時間がかかるだけでなく、倫理的な懸念も引き起こします。最近では、脳オルガノイド技術9,10の開発が、以前のモデル11,12,13,14,15,16の制限の多くを解決する有望な代替手段として浮上している。
脳オルガノイドは、3次元(3D)の多細胞構造であり、定義された発生時間ウィンドウ11、12、13、14、17に対する1つまたは複数の脳領域の細胞構造および細胞型組成の主な特徴をエミュレートする。これらの3D構造は、人工多能性幹細胞(iPSC)から、または目的の種で利用可能な場合は胚性幹細胞(ESC)から生成されます。一般に、2種類の脳オルガノイドは、使用される方法論に基づいて区別することができる:ガイドなしおよび局所化(ガイド付き)脳オルガノイド18。後者のタイプのオルガノイドを生成する際には、多能性幹細胞を特定の脳領域のオルガノイド(例えば、前脳オルガノイド)に分化させる小分子または因子が提供される18。対照的に、非誘導オルガノイドでは、分化は低分子の添加によって導かれるのではなく、iPSC/ESCの自然分化にのみ依存します。結果として得られる脳オルガノイドは、異なる脳領域を表す細胞型(例えば、大脳オルガノイド)からなる18。脳オルガノイドは、脳発生の多くの重要な特徴と、iPS細胞またはESCが利用可能なあらゆる対象種からの比較的コスト効率と時間効率の高い生成を兼ね備えています11、12、13、14。これにより、脳オルガノイドは、進化的および発達的問題から疾患モデリングや薬物検査に至るまで、多くの種類の神経生物学的研究の優れたモデルになります15,16。しかし、脳オルガノイドを使用してこのような問題に取り組むことは、遺伝子組み換えのためのさまざまな方法の利用可能性に強く依存します。
新皮質(病)生理学的発達とその進化を研究する上で重要な側面の1つは、遺伝子と遺伝子変異の機能解析です。これは通常、(異所性)発現および/またはそれらの遺伝子のノックダウン(KD)またはノックアウト(KO)によって達成される。このような遺伝子改変は、安定な遺伝子改変と一過性の遺伝子改変、ならびに時間的および空間的に制限されている改変または制限されていない改変に分類することができる。安定した遺伝子組み換えは、その後のすべての細胞世代に受け継がれる宿主ゲノムへの遺伝子改変の導入によって定義されます。遺伝子組み換えの時点に応じて、オルガノイドのすべての細胞に影響を与えるか、特定の細胞集団に制限される可能性があります。ほとんどの場合、レンチウイルス、トランスポゾン様システム、およびCRISPR/Cas9技術を適用することにより、iPSC/ESCレベルで脳オルガノイドで安定した遺伝子改変が達成されます(例えば、Fischer et al.17、Kyrousi et al.19、およびTeriyapirom et al.20によってレビューされています)。これは、脳オルガノイドのすべての細胞が遺伝子組み換えを持ち、時間的または空間的に制限されないという利点があります。しかし、これらの安定なiPSC/ESC株の生成と特性評価は非常に時間がかかり、最初の改変された脳オルガノイドが分析されるまでに数か月かかることがよくあります(例えば、Fischer et al.17、Kyrousi et al.19、またはTeriyapirom et al.20によってレビューされています)。
対照的に、一過性の遺伝子改変は、宿主ゲノムに組み込まれない遺伝的貨物(例えば、遺伝子発現プラスミド)の送達によって定義される。この修飾は、原則として、次の細胞世代に受け継がれる可能性がありますが、送達された遺伝子貨物は、細胞分裂ごとに徐々に希釈されます。したがって、このタイプの遺伝子組み換えは通常、時間的および空間的に制限されています。一過性の遺伝子改変は、アデノ随伴ウイルスまたはエレクトロポレーション(例えば、Fischer et al.17、Kyrousi et al.19、およびTeriyapirom et al.20によってレビューされている)によって脳オルガノイドで実行することができ、後者はこの記事で詳細に説明されています。安定した遺伝子組み換えとは対照的に、このアプローチは非常に高速で費用効果が高いです。実際、エレクトロポレーションは数分以内に実行でき、標的細胞集団によっては、エレクトロポレーションされたオルガノイドは数日以内に分析の準備が整います(Fischer et al.17およびKyrousi et al.19などによってレビューされています)。しかし、大きさの違いなどの脳オルガノイドの全体的な形態学的変化は、この種の遺伝子組み換えが時間的および空間的に制限されているため、この方法では検出できません。この制限は、例えば、オルガノイド内の個々の細胞集団または特定の発生時点における脳オルガノイドへの影響を研究する場合にも利点となり得る(例えば、Fischer et al.17およびKyrousi et al.19によってレビューされた)。
脳の発生と進化の間の遺伝子機能を研究するための古典的なアプローチは、子宮エレクトロポレーションです。子宮内エレクトロポレーションは、げっ歯類21、22、23およびフェレット24、25脳への遺伝子発現構築物の送達のための周知かつ有用な技術である。まず、目的の発現コンストラクトを含む溶液を、標的とする領域に応じて、子宮壁を介して胚性脳の特定の心室にマイクロインジェクションします。第2ステップでは、電気パルスを適用して、標的心室を直接裏打ちする細胞をトランスフェクトします。このアプローチは、異所性発現または遺伝子の過剰発現に限定されるものではなく、それぞれショートヘアピン(shRNA)またはCRISPR/Cas9(発現プラスミドまたはリボ核タンパク質[RNP]の形態)をマイクロインジェクションすることにより、KDまたはKO研究にも適用できます26,27。しかしながら、マウス、ラット、およびフェレット胚の子宮内エレクトロポレーションには、これらの動物モデルについて上述したのと同じ制限がある。
理想的には、霊長類で直接 子宮内 エレクトロポレーションを行いたいと考えています。これは原則として技術的に可能ですが、 子宮内 エレクトロポレーションは、倫理的懸念、高い動物維持費、および小さな産仔サイズのために霊長類では行われません。類人猿(人間を含む)などの特定の霊長類では、これはまったく不可能です。しかし、これらの霊長類は、ヒト(病的)生理学的新皮質の発達とその進化の研究に最も大きな可能性を秘めています。このジレンマに対する1つの解決策は、霊長類の脳オルガノイドにエレクトロポレーション技術を適用することである28。
この論文は、霊長類の脳オルガノイドのサブタイプである霊長類の大脳オルガノイドのエレクトロポレーションのためのプロトコルを提示します。このアプローチにより、オルガノイドの心室様構造内の細胞集団の迅速かつ費用効果の高い遺伝子改変が可能になります。具体的には、ヒト(ホモサピエンス)、チンパンジー(パントログロダイト)、アカゲザル(マカカムラッタ)、およびコモンマーモセット(Callithrix jacchus)iPS細胞から霊長類の大脳オルガノイドを生成するための統一プロトコルについて説明します。さらに、マイクロインジェクションとエレクトロポレーションの手法について詳しく説明し、霊長類の脳オルガノイドエレクトロポレーションを行うための「go」と「no-go」の基準を提供します。このアプローチは、特に人間の状況に近いモデルで(病的)生理学的新皮質の発達とその進化を研究するための効果的なツールです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する手順は、ターゲットを絞ったエレクトロポレーションアプローチを用いて、異なる霊長類種から脳オルガノイドを生成するための統一されたプロトコルを表しています。これにより、霊長類(ヒトを含む)(病的)生理学的新皮質発達をエミュレートするモデルシステムにおけるGOIの異所性発現が可能になります。霊長類大脳オルガノイドの生成のためのこの統一されたプロトコル…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
スペースの都合上、研究内容を引用できなかった研究者の皆様にお詫び申し上げます。ペトリ皿電極チャンバーの建設について、DPZの技術サービスのウルリッヒ・ブレイヤーとMPI-CBGのワークショップのハルトムート・ヴォルフに感謝します。ストヤン・ペトコフとリューディガー・ベーアは、ヒト(iLonza2.2)、アカゲザル(iRh33.1)、マーモセット(cj_160419_5)のiPS細胞を提供しました。サブリナ・ハイデ 凍結切開および免疫蛍光染色用;ネリンガ・リウティカイテとセザール・マテオ・バスティダス・ベタンクールは、原稿を批判的に読んでくれました。W.B.H.の研究室での作業は、ERA-NET NEURON(MICROKin)の助成金によってサポートされました。M.H.の研究室での作業は、ERC開始助成金(101039421)によってサポートされました。
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
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