Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Investigar o desenvolvimento (pato)fisiológico e a evolução do córtex cerebral é uma tarefa formidável que é dificultada pela falta de sistemas modelo adequados. Anteriormente, tais estudos estavam confinados a modelos bidimensionais de cultura celular (como progenitor neural primário ou culturas de células neuronais) e modelos animais evolutivamente distantes (como roedores)^1,2. Embora esses modelos sejam úteis para abordar certas questões, eles são limitados na modelagem da complexidade, composição do tipo celular, arquitetura celular e padrões de expressão gênica do neocórtex humano em desenvolvimento em estados saudáveis e doentes. Essas limitações levam, por exemplo, à baixa traduzibilidade de modelos murinos de doenças humanas para a situação humana, como descrito para certos casos de microcefalia (por exemplo, Zhang et ^al.3). Recentemente, primatas não humanos transgênicos, que são um modelo evolutiva, funcional e morfologicamente mais próximo do desenvolvimento do neocórtex humano, têm entrado em foco 4,5,6,7,8 à medida que superam muitas limitações dos modelos baseados em cultura celular e roedores. No entanto, o uso de primatas não humanos em pesquisas não é apenas altamente caro e demorado, mas também levanta preocupações éticas. Mais recentemente, o desenvolvimento da tecnologia de organoides^{cerebrais9,10} surgiu como uma alternativa promissora que resolve muitas das limitações de modelos anteriores11,12,13,14,15,16.

Os organoides cerebrais são estruturas tridimensionais (3D), multicelulares, que emulam as principais características da citoarquitetura e composição celular-tipo de uma ou múltiplas regiões cerebrais para uma janela de tempo de desenvolvimento definida11,12,13,14,17. Essas estruturas 3D são geradas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ou, se disponíveis para a espécie de interesse, a partir de células-tronco embrionárias (CTEs). Em geral, dois tipos de organoides cerebrais podem ser distinguidos com base na metodologia utilizada: organoides cerebrais não guiados e regionalizados (guiados)¹⁸. Na geração deste último tipo de organoides, são fornecidas pequenas moléculas ou fatores que orientam a diferenciação das células-tronco pluripotentes em organoides de uma determinada região do cérebro (por exemplo, organoides do prosencéfalo)¹⁸. Por outro lado, em organoides não guiados, a diferenciação não é guiada pela adição de pequenas moléculas, mas depende exclusivamente da diferenciação espontânea das iPSCs/ESCs. Os organoides cerebrais resultantes consistem em tipos celulares que representam diferentes regiões cerebrais (por exemplo, organoides cerebrais)¹⁸. Os organoides cerebrais combinam muitas características-chave do desenvolvimento cerebral com uma geração relativamente eficiente em termos de custo e tempo a partir de qualquer espécie de interesse para a qual as iPSCs ou ESCs estejam disponíveis^11,12,13,14. Isso faz dos organoides cerebrais um excelente modelo para muitos tipos de estudos neurobiológicos, desde questões evolutivas e de desenvolvimento até modelagem de doenças e testes de drogas^15,16. No entanto, a abordagem de tais questões usando organoides cerebrais depende fortemente da disponibilidade de diferentes métodos para modificação genética.

Um aspecto fundamental do estudo do desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex e sua evolução é a análise funcional de genes e variantes gênicas. Isso geralmente é conseguido pela expressão (ectópica) e/ou por knock-down (KD) ou knock-out (KO) desses genes. Tais modificações genéticas podem ser classificadas em modificações genéticas estáveis e transitórias, bem como em modificações restritas temporal e espacialmente ou não restritas. A modificação genética estável é definida pela introdução de uma alteração genética no genoma do hospedeiro que é transmitida a todas as gerações celulares subsequentes. Dependendo do momento da modificação genética, pode afetar todas as células de um organoide ou pode ser restrito a determinadas populações celulares. Mais frequentemente, a modificação genética estável é obtida em organoides cerebrais no nível iPSC/ESC através da aplicação de lentivírus, sistemas semelhantes a transposons e a tecnologia CRISPR/Cas9 (revisada por, por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 e Teriyapirom et ^al.20). Isso tem a vantagem de que todas as células do organoide cerebral carregam a modificação genética e que ela não é restrita temporal ou espacialmente. No entanto, a geração e a caracterização dessas linhagens estáveis de iPSC/ESC são muito demoradas, muitas vezes levando vários meses até que os primeiros organoides cerebrais modificados possam ser analisados (revisados por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 ou Teriyapirom et ^al.20).

Em contraste, a modificação genética transitória é definida pela entrega de carga genética (por exemplo, um plasmídeo de expressão gênica) que não se integra ao genoma do hospedeiro. Embora essa modificação possa, em princípio, ser passada para as gerações celulares subsequentes, a carga genética entregue será progressivamente diluída a cada divisão celular. Portanto, esse tipo de modificação genética costuma ser restrita temporal e espacialmente. A modificação genética transitória pode ser realizada em organoides cerebrais por vírus adenoassociados ou por eletroporação (revisada por, por exemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et ^al.19 e Teriyapirom et ^al.20), sendo esta última descrita em detalhes neste artigo. Em contraste com a modificação genética estável, esta abordagem é muito rápida e econômica. De fato, a eletroporação pode ser realizada em poucos minutos e, dependendo da(s) população(ões) de células-alvo, os organoides eletroporados estão prontos para análise em poucos dias (revisados por, por exemplo, Fischer et al.17 e Kyrousi et ^al.19). No entanto, alterações morfológicas macroscópicas do organoide cerebral, como diferenças de tamanho, não podem ser detectadas por esse método, pois esse tipo de modificação genética é restrita temporal e espacialmente. Essa restrição também pode ser uma vantagem, por exemplo, no caso de estudar populações celulares individuais dentro do organoide ou os efeitos sobre organoides cerebrais em momentos específicos de desenvolvimento (revisados por, por exemplo, Fischer et al.17 e Kyrousi et ^al.19).

Uma abordagem clássica para estudar a função gênica durante o desenvolvimento e evolução cerebral é a eletroporação in utero. A eletroporação in utero é uma técnica bem conhecida e útil para a liberação de construções de expressão gênica em cérebros de roedores 21,22,23 e furões ^24,25. Primeiro, uma solução contendo o(s) construto(s) de expressão de interesse é microinjetada através da parede uterina em um determinado ventrículo do cérebro embrionário, dependendo da região a ser alvo. Na segunda etapa, pulsos elétricos são aplicados para transfectar as células que revestem diretamente o ventrículo alvo. Essa abordagem não se limita apenas à expressão ectópica ou à superexpressão de genes, como também pode ser aplicada em estudos de KD ou KO por microinjeção de hairpin curto (shRNA) ou CRISPR/Cas9 (na forma de plasmídeos de expressão ou ribonucleoproteínas [RNPs]), respectivamente^26,27. No entanto, a eletroporação in utero de embriões de camundongos, ratos e furões tem as mesmas limitações descritas acima para esses modelos animais.

O ideal seria realizar eletroporação in utero diretamente em primatas. Embora isso seja, em princípio, tecnicamente possível, a eletroporação in utero não é realizada em primatas devido a preocupações éticas, altos custos de manutenção animal e pequenos tamanhos de ninhada. Para certos primatas, como grandes símios (incluindo humanos), isso não é possível. No entanto, esses primatas têm o maior potencial para o estudo do desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex humano e sua evolução. Uma solução para esse dilema é aplicar a técnica de eletroporação aos organoides cerebrais de primatas²⁸.

Este trabalho apresenta um protocolo para a eletroporação de um subtipo de organoides cerebrais de primatas, organoides cerebrais de primatas. Essa abordagem permite a modificação genética rápida e econômica de populações celulares dentro das estruturas semelhantes aos ventrículos dos organoides. Especificamente, descrevemos um protocolo unificado para a geração de organoides cerebrais de primatas a partir de iPSCs humanas (Homo sapiens), chimpanzés (Pan troglodytes), macacos rhesus (Macaca mulatta) e sagui-comum (Callithrix jacchus). Além disso, descrevemos a técnica de microinjeção e eletroporação em detalhes e fornecemos critérios “go” e “no-go” para a realização da eletroporação organoide cerebral de primatas. Esta abordagem é uma ferramenta eficaz para estudar o desenvolvimento (pato)fisiológico do neocórtex e sua evolução em um modelo especialmente próximo da situação humana.