Primat serebral organoidlerinin elektroporasyonu, primat (pato) fizyolojik neokorteks gelişimine yakın bir model sistemde farklı progenitör tiplerine ve nöronlara geçici genetik modifikasyonları tanıtmak için kesin ve etkili bir yaklaşım sağlar. Bu, nörogelişimsel ve evrimsel süreçlerin incelenmesine izin verir ve hastalık modellemesi için de uygulanabilir.
Serebral korteks en dıştaki beyin yapısıdır ve duyusal girdi ve motor çıktının işlenmesinden sorumludur; memelilerde, özellikle primatlarda üst düzey bilişsel yeteneklerin yeri olarak görülür. Primatların beyinlerindeki gen fonksiyonlarını incelemek teknik ve etik nedenlerden dolayı zordur, ancak beyin organoid teknolojisinin kurulması, geleneksel primat modellerinde (örneğin, rhesus makak ve ortak marmoset) ve daha önce deneysel olarak erişilemeyen primat türlerinde (örneğin, büyük maymunlar), etik olarak haklı ve daha az teknik olarak talep edilen bir sistemde beyin gelişiminin incelenmesini sağlamıştır. Dahası, insan beyni organoidleri nörogelişimsel ve nörolojik bozuklukların ileri düzeyde araştırılmasına izin verir.
Beyin organoidleri beyin gelişiminin birçok sürecini özetlerken, aynı zamanda evrimsel bağlamda çeşitli türlerin beyin gelişiminin altında yatan genetik belirleyicilerdeki farklılıkları tanımlamak ve işlevsel olarak karşılaştırmak için güçlü bir aracı temsil ederler. Organoidleri kullanmanın büyük bir avantajı, gen fonksiyonlarının test edilmesine izin veren genetik modifikasyonları tanıtma olasılığıdır. Bununla birlikte, bu tür değişikliklerin uygulanması zahmetli ve pahalıdır. Bu yazıda, beyin organoidlerinin bir alt tipi olan primat serebral organoidlerinin ventrikül benzeri yapılarındaki hücre popülasyonlarını genetik olarak değiştirmek için hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu yöntem, insan, şempanze, rhesus makak ve yaygın marmoset kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) serebral organoidlerin güvenilir bir şekilde üretilmesi için modifiye edilmiş bir protokolü mikroenjeksiyon ve elektroporasyon yaklaşımı ile birleştirir. Bu, hastalık modellemesi için de uygulanabilecek nörogelişimsel ve evrimsel süreçlerin incelenmesi için etkili bir araç sağlar.
Serebral korteksin (pato) fizyolojik gelişimini ve evrimini araştırmak, uygun model sistemlerinin eksikliği nedeniyle engellenen zorlu bir görevdir. Önceden, bu tür çalışmalar iki boyutlu hücre kültürü modelleri (birincil nöral progenitör veya nöronal hücre kültürleri gibi) ve evrimsel olarak uzak hayvan modelleri (kemirgenler gibi) ile sınırlıydı1,2. Bu modeller belirli soruları ele almak için yararlı olsa da, sağlıklı ve hastalıklı durumlarda gelişmekte olan insan neokorteksinin karmaşıklığını, hücre tipi bileşimini, hücresel mimarisini ve gen ekspresyon kalıplarını modellemede sınırlıdır. Bu sınırlamalar, örneğin, bazı mikrosefali vakaları için açıklandığı gibi, insan hastalıklarının fare modellerinin insan durumuna zayıf bir şekilde çevrilebilirliğine yol açmaktadır (örneğin, Zhang ve ark.3). Son zamanlarda, insan neokorteks gelişiminin evrimsel, işlevsel ve morfolojik olarak daha yakın bir modeli olan transgenik insan dışı primatlar, hücre kültürü ve kemirgen bazlı modellerin birçok sınırlamasının üstesinden geldikleri için 4,5,6,7,8’e odaklanmıştır. Bununla birlikte, insan olmayan primatların araştırmalarda kullanılması sadece oldukça pahalı ve zaman alıcı değil, aynı zamanda etik kaygıları da beraberinde getirmektedir. Daha yakın zamanlarda, beyin organoid teknolojisinin gelişimi 9,10, önceki modellerin sınırlamalarının çoğunu çözen umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır 11,12,13,14,15,16.
Beyin organoidleri, tanımlanmış bir gelişimsel zaman penceresi 11,12,13,14,17 için bir veya daha fazla beyin bölgesinin sitomimarisinin ve hücre tipi bileşiminin temel özelliklerini taklit eden üç boyutlu (3D), çok hücreli yapılardır. Bu 3D yapılar ya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) ya da ilgilenilen türler için mevcutsa, embriyonik kök hücrelerden (ESC’ler) üretilir. Genel olarak, kullanılan metodolojiye dayanarak iki tip beyin organoidi ayırt edilebilir: rehbersiz ve bölgeselleştirilmiş (rehberli) beyin organoidleri18. İkinci tip organoidlerin üretilmesinde, pluripotent kök hücrelerin belirli bir beyin bölgesinin organoidlerine (örneğin, ön beyin organoidleri) farklılaşmasına rehberlik eden küçük moleküller veya faktörler sağlanır18. Buna karşılık, kılavuzsuz organoidlerde, farklılaşma küçük moleküllerin eklenmesiyle yönlendirilmez, bunun yerine yalnızca iPSC’lerin / ESC’lerin kendiliğinden farklılaşmasına dayanır. Ortaya çıkan beyin organoidleri, farklı beyin bölgelerini (örneğin, serebral organoidler) temsil eden hücre tiplerinden oluşur18. Beyin organoidleri, beyin gelişiminin birçok temel özelliğini, iPSC’lerin veya ESC’lerin mevcut olduğu herhangi bir ilgi türünden nispeten uygun maliyetli ve zaman tasarruflu üretim ile birleştirir11,12,13,14. Bu, beyin organoidlerini, evrimsel ve gelişimsel sorulardan hastalık modellemesine ve uyuşturucu testine kadar birçok nörobiyolojik çalışma için mükemmel bir model haline getirir15,16. Bununla birlikte, beyin organoidlerini kullanarak bu tür soruları ele almak, genetik modifikasyon için farklı yöntemlerin mevcudiyetine bağlıdır.
Neokorteks (pato) fizyolojik gelişimini ve evrimini incelemenin kilit yönlerinden biri, genlerin ve gen varyantlarının fonksiyonel analizidir. Bu genellikle (ektopik) ekspresyon ve / veya bu genlerin knock-down (KD) veya knock-out (KO) ile elde edilir. Bu tür genetik modifikasyonlar, kararlı ve geçici genetik modifikasyonlar olarak sınıflandırılabileceği gibi, modifikasyonlar geçici ve mekansal olarak kısıtlanmış veya kısıtlanmamış olarak da sınıflandırılabilir. Kararlı genetik modifikasyon, konakçı genomuna genetik bir değişikliğin girmesiyle tanımlanır ve bu da sonraki tüm hücre nesillerine aktarılır. Genetik modifikasyonun zaman noktasına bağlı olarak, bir organoidin tüm hücrelerini etkileyebilir veya belirli hücre popülasyonlarıyla sınırlı olabilir. En sık olarak, iPSC / ESC seviyesindeki beyin organoidlerinde lentivirüsler, transpozon benzeri sistemler ve CRISPR / Cas9 teknolojisi uygulanarak kararlı genetik modifikasyon elde edilir (örneğin, Fischer ve ark.17, Kyrousi ve ark.19 ve Teriyapirom ve ark.20 tarafından gözden geçirilmiştir). Bu, beyin organoidinin tüm hücrelerinin genetik modifikasyonu taşıması ve geçici veya mekansal olarak kısıtlanmaması avantajına sahiptir. Bununla birlikte, bu kararlı iPSC / ESC hatlarının oluşturulması ve karakterizasyonu çok zaman alıcıdır, ilk modifiye beyin organoidlerinin analiz edilebilmesi için genellikle birkaç ay sürer (örneğin, Fischer ve ark.17, Kyrousi ve ark.19 veya Teriyapirom ve ark.20 tarafından gözden geçirilmiştir).
Buna karşılık, geçici genetik modifikasyon, konakçı genomuna entegre olmayan genetik yükün (örneğin, bir gen ekspresyon plazmidi) verilmesiyle tanımlanır. Bu modifikasyon, prensip olarak, sonraki hücre nesillerine aktarılabilirken, teslim edilen genetik kargo, her hücre bölünmesiyle aşamalı olarak seyreltilecektir. Bu nedenle, bu tür genetik modifikasyon genellikle geçici ve mekansal olarak kısıtlanır. Geçici genetik modifikasyon, beyin organoidlerinde adeno ile ilişkili virüsler veya elektroporasyon (örneğin, Fischer ve ark.17, Kyrousi ve ark.19 ve Teriyapirom ve ark.20 tarafından gözden geçirilmiştir) tarafından gerçekleştirilebilir. Kararlı genetik modifikasyonun aksine, bu yaklaşım çok hızlı ve uygun maliyetlidir. Gerçekten de, elektroporasyon dakikalar içinde gerçekleştirilebilir ve hedef hücre popülasyonlarına bağlı olarak, elektropora organoidler günler içinde analiz için hazırdır (örneğin, Fischer ve ark.17 ve Kyrousi ve ark.19 tarafından gözden geçirilmiştir). Bununla birlikte, beyin organoidinin boyut farklılıkları gibi brüt morfolojik değişiklikleri, bu yöntem kullanılarak tespit edilemez, çünkü bu tür genetik modifikasyon geçici ve mekansal olarak kısıtlanır. Bu kısıtlama, örneğin, organoid içindeki bireysel hücre popülasyonlarını veya belirli gelişimsel zaman noktalarında beyin organoidleri üzerindeki etkilerini incelemek durumunda da bir avantaj olabilir (örneğin, Fischer ve ark.17 ve Kyrousi ve ark.19 tarafından gözden geçirilmiştir).
Beyin gelişimi ve evrimi sırasında gen fonksiyonunu incelemek için klasik bir yaklaşım in utero elektroporasyondur. In utero elektroporasyon, gen ekspresyon yapılarının kemirgen 21,22,23 ve gelincik 24,25 beyinlerine verilmesi için iyi bilinen ve kullanışlı bir tekniktir. İlk olarak, ilgilenilen ekspresyon yapılarını içeren bir çözelti, hedeflenecek bölgeye bağlı olarak, uterus duvarından embriyonik beynin belirli bir ventrikülüne mikroenjekte edilir. İkinci adımda, hedeflenen ventrikülü doğrudan kaplayan hücreleri transfekte etmek için elektrik darbeleri uygulanır. Bu yaklaşım sadece ektopik ekspresyon veya genlerin aşırı ekspresyonu ile sınırlı değildir, çünkü KD veya KO çalışmalarında kısa saç tokası (shRNA) veya CRISPR / Cas9 (ekspresyon plazmidleri veya ribonükleoproteinler [RNP’ler] şeklinde) mikroenjeksiyonu ile de uygulanabilir. sırasıyla26,27. Bununla birlikte, fare, sıçan ve gelincik embriyolarının in utero elektroporasyonu, bu hayvan modelleri için yukarıda tarif edildiği gibi aynı sınırlamalara sahiptir.
İdeal olarak, kişi in utero elektroporasyonunu doğrudan primatlarda gerçekleştirmek ister. Bu, prensip olarak, teknik olarak mümkün olsa da, in utero elektroporasyon, etik kaygılar, yüksek hayvan bakım maliyetleri ve küçük çöp boyutları nedeniyle primatlarda yapılmaz. Büyük maymunlar (insanlar dahil) gibi bazı primatlar için bu hiç mümkün değildir. Bununla birlikte, bu primatlar, insan (pato) fizyolojik neokorteks gelişimi ve evriminin incelenmesi için en büyük potansiyele sahiptir. Bu ikilemin bir çözümü, elektroporasyon tekniğini primat beyin organoidlerineuygulamaktır 28.
Bu yazıda, primat beyin organoidlerinin bir alt tipi olan primat serebral organoidlerinin elektroporasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşım, organoidlerin ventrikül benzeri yapıları içindeki hücre popülasyonlarının hızlı ve uygun maliyetli genetik modifikasyonuna izin verir. Spesifik olarak, insan (Homo sapiens), şempanze (Pan troglodytes), rhesus makak (Macaca mulatta) ve ortak marmoset (Callithrix jacchus) iPSC’lerinden primat serebral organoidlerinin üretimi için birleşik bir protokol tanımlıyoruz. Ayrıca, mikroenjeksiyon ve elektroporasyon tekniğini ayrıntılı olarak tanımlıyoruz ve primat serebral organoid elektroporasyonunu gerçekleştirmek için “git” ve “gitme” kriterlerini sağlıyoruz. Bu yaklaşım, (pato)fizyolojik neokorteks gelişimini ve evrimini özellikle insan durumuna yakın bir modelde incelemek için etkili bir araçtır.
Burada açıklanan prosedürler, hedefli bir elektroporasyon yaklaşımı ile farklı primat türlerinden serebral organoidlerin üretilmesi için birleşik bir protokolü temsil etmektedir. Bu, primat (insan dahil) (pato) fizyolojik neokorteks gelişimini taklit eden bir model sistemde bir GOI’nin ektopik ekspresyonuna izin verir. Primat serebral organoidlerinin üretimi için bu birleşik protokol, sunulan dört primat türünün tümü için aynı malzemeleri (örneğin, medya) ve protokol adımlarını kullanır. Bu …
The authors have nothing to disclose.
Alan sınırlamaları nedeniyle çalışmalarına atıf yapılamayan tüm araştırmacılardan özür dileriz. DPZ’deki teknik servislerden Ulrich Bleyer’e ve MPI-CBG’deki atölyeden Hartmut Wolf’a Petri çanak elektrot odalarının yapımı için teşekkür ederiz; Stoyan Petkov ve Rüdiger Behr, insan (iLonza2.2), rhesus makak (iRh33.1) ve marmoset (cj_160419_5) iPSC’leri sağladıkları için; Kriyoseksiyon ve immünofloresan boyama için Sabrina Heide; ve Neringa Liutikaite ve César Mateo Bastidas Betancourt, el yazmasını eleştirel olarak okudukları için. W.B.H. laboratuvarındaki çalışmalar bir ERA-NET NEURON (MicroKin) hibesi ile desteklendi. M.H.’nin laboratuvarındaki çalışmalar ERC başlangıç hibesi (101039421) ile desteklenmiştir.
20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |