EpCAMおよびサイトケラチンが正常なヒトおよびマウスの血液および骨髄において上皮細胞を発現する証拠

すべての動物プロトコルは、NIHおよび連邦ガイドラインに従って、ミネソタ大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。新鮮な人間の血液と骨髄は商業的な供給源から購入されました。サンプルは、HIV、B型肝炎、C型肝炎に陰性のドナーから承認されたIRBプロトコルの下で会社によって収集され、COVID-19のスクリーニングを受けました。すべてのサンプルは、会社によって出荷される前に、最初に匿名化され、匿名化されました。これらは商業的に入手されたため、IRBの承認は必要ありませんでした。 1.溶液の調製 注:すべての溶液は、無菌環境の生物学的フードで調製する必要があります。ヒトの血液および骨髄を扱う作業のためのバイオセーフティレベル2(BSL2)認証を取得します。 1 mLのゲンタマイシンと5 mLのウシ胎児血清(FBS)を500 mLのハンクスバランス塩溶液(HBSS)に加えて、骨髄採取溶液を調製します。 500 mLのHBSSに50 mLのFBSを加えて染色緩衝液を調製します。 10 mLの10x溶解バッファーと90 mLの滅菌水を組み合わせて、1x溶解バッファーを調製します。 2.フードの準備 フードをオンにし、適切な空気の流れを得るために数分間稼働させます。 骨髄採取を行うためにすべての材料を収集します。無菌環境を維持するために、フード内に70%エタノールをスプレーします。フードの中に入れる前に、毎回手をスプレーしてください。 オートクレーブ処理したトレイを、オートクレーブ処理したはさみ、組み立てたメス、ピンセット、湾曲した鉗子とともに、70%エタノールで満たされた小さなカップに入れて無菌状態に保ちます。 10 mLの骨髄採取溶液を1本の50 mL遠沈管に加え、「四肢」とラベル付けします。別の50mL遠心チューブに「骨髄」というラベルを付けます。 10 mLの骨髄採取液を注射器に吸い込み、26 Gの針を取り付けます。 3.マウスからの骨髄の採取 CO2 窒息を用いてマウスを安楽死させる。死は、心拍がなく、反応がないことを確認するために足をつまむことによって確認されます。子宮頸部脱臼は、完全な安楽死の二次的な手段として行うことができます。 マウスを500 mLの容器に入れ、マウスの半分を覆うのに十分なヨウ素を加えます。容器をゆっくりと振って回転させ、完全にカバーします。脱イオン水ですすいでください。ヨウ素洗浄をもう1回実行し、次に同じ手順に従って70%エタノールで2回洗浄します。 マウスをフードに置き、トレイの上に仰向けに置きます。後ろ足をつかみ、ポップが感じられるまで引き離します。これは足を背骨から分離するためです。 鼠径部近くのマウスの皮膚を1cm切開します。閉じたハサミを切開部に挿入し、次に皮膚の下のハサミを開いて腹膜から分離します。 太ももの周りの脚の皮膚を切り、次に脚の下の皮膚を切り開いて筋肉と骨を露出させます。 大腿骨を切断しないようにしながら、股関節の周りを切断して後ろ足を取り外します。「手足」とラベル付けされたチューブに手足を置きます両足を取り外したら、マウスをカーカスバッグに入れて冷凍庫に入れます。注:骨髄のほとんどは大腿骨から得られるため、はさみをガイドし、大腿骨を切断しないように切断する前に、最初に腰骨を感じる必要があります。 はさみを使用して、手足の1つに沿って筋肉、組織、脂肪を切り取り始めます。骨と平行に切ります。次に、メスを使用して、骨に対して垂直にこする動きを使用して、残りの脂肪または筋肉を取り除きます。 骨が適切に洗浄されたら、膝で大腿骨と脛骨を分離します。メスを使用して、骨髄が見えない大腿骨と脛骨の両端に切り込みを入れます。 準備した注射器と針を骨に挿入します。抵抗がある場合は、抵抗がなくなるまで骨の端をもう少し切り取ります。「骨髄」とラベル付けされたチューブの上に骨を保持しながら、骨髄採取溶液を骨から排出し、骨髄をチューブに洗い流します。骨のもう一方の端で繰り返して、骨がすべて白または空になるまで、骨髄の残りの部分を取得します。 残りのすべての骨と手足について手順7〜9を繰り返します。すべての骨髄は同じ円錐形のチューブに洗い流されます。 空の10 mLシリンジと20 G針を使用して、シリンジ内で骨髄を上下に5〜10回描画することにより、チューブ内の骨髄の塊を破壊します。 滅菌40 μmフィルターを清潔な50 mL遠沈管に加え、1 mLの骨髄採取液ですすいでください。次に、骨髄をろ過して、残っている塊を取り除きます。このチューブに「ろ過骨髄」というラベルを付けます。 ろ過した骨髄は、使用するまで冷蔵庫または氷の上に保管してください。収穫の同じ日に使用する必要があります。同じ日に使用しない場合は、ジメチルスルホキシド(DMSO)などの凍結保存剤を使用して細胞を凍結します。注意: これらの実験からのすべての廃棄物は、バイオハザード廃棄物容器に適切に廃棄する必要があります。すべての鋭利物は、適切にラベル付けされたバイオハザード鋭利物容器に入れる必要があります。 4.骨髄の赤血球溶解 骨髄細胞を170 x g で室温で10分間遠心分離します。上澄み液を掃除機で処理します。細胞を10 mLの1x赤血球溶解バッファーに再懸濁し、4分間インキュベートします。 30 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を加えて、溶解緩衝液の反応を停止します。細胞を室温で170 x g で8分間遠心分離します。上澄み液を掃除機で処理します。10〜20 mLの染色バッファーに再懸濁します。 5.細胞数 500 μlの細胞を9.5 mLの骨髄採取溶液と組み合わせて、1:20希釈液を得ます。注:これは細胞数に使用され、無菌状態に保つ必要はありません。 1:20希釈液から200 μLの細胞を引き出し、200 μLのトリパンブルーに加え、よく混ぜます。 混合物を血球計算盤に加え、両側の生細胞と死細胞を数えます。この表( 補足ファイル1に表示)と式を使用して、元の細胞懸濁液を計算します。ミリリットルあたりのセル数:総セル数: 細胞を170 x g で4°Cで10分間スピンダウンし、抗体希釈に関するメーカーの提案に基づいて、1 mLあたり10 x 10 6(100 μLあたり1 x 106 細胞)の濃度に再懸濁します。 フローサイトメトリーに進みます(ステップ8)。 6.マウスからの採血 CO2 ガスまたは頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させる。 0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)でコーティングされた1 mLシリンジに26 Gの針を取り付けて、45°の角度で心臓採血を行います。 血液をスピンダウンし、培地または染色バッファーに再懸濁します。注:細胞はスピンダウンされ、赤血球の溶解と細胞数の後に染色バッファーに最終濃度まで再懸濁されます。 赤血球溶解を行う(ステップ4)。 セルカウントを実行します(ステップ5)。 フローサイトメトリーに進みます(ステップ8)。 7.ヒトの血液および骨髄サンプルの処理 個人用保護具を着用しながら、BSL2認定のフードの下ですべての手順を実行してください。 前夜にサンプルを収集し、赤血球溶解を行います。単核サンプルを氷上で一晩輸送する前に、サンプルが匿名化されていることを確認してください。 到着したら、生細胞を170 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。注:これらはBSL2サンプルであり、地域のガイドラインに従う必要があります。 細胞を培地または染色バッファーに再懸濁します。注:細胞をスピンダウンし、染色バッファーで細胞計数した後、最終濃度に再懸濁する必要があります。 セルカウントを実行します(ステップ5)。 フローサイトメトリーに進みます(ステップ8)。 8. フローサイトメトリー 染色使用する染色パネルに基づいて、補正コントロール(非染色、アイソタイプコントロール、単一染色、蛍光マイナス1[FMO])を含む、細胞を個別に標識したチューブに分割します。残りの細胞を凍結するか、蛍光活性化細胞ソーティングに使用します。使用した抗体希釈液を用いた染色パネルの例については 、表1 を参照されたい。注:蛍光色素を追加するたびに、残りの蛍光色素と組み合わせたFMOを、その蛍光色素の単一の染色剤とともに添加する必要があります。アイソタイプコントロールは、非特異的染色をブロックするために使用できます。使用する新しい抗体はそれぞれ、最適な希釈のためにサンプルで滴定する必要があります。 メーカー推奨希釈率に従って抗体を加え、チューブの底をフリックしてよく混ぜます。抗体濃度は通常、100 μLあたり1 x 106 細胞として与えられます。 抗体およびコントロールによる希釈を 表1に示す。抗体は蛍光色素と結合しており、光から保護する必要があります。注:フィコエリスリン(PE)に結合したEpCAMを使用すると、細胞の低集団を視覚化できます( 表1に示すように、100万細胞あたり3〜5 μLの滴定液)。PE-CD49fはPE-EpCAMよりも普及しており、補償に使いやすいため、単一染色PEコントロール(100万細胞あたり20 μL)として使用されました。 暗所で4°Cで30分間インキュベートします。 インキュベーション後、チューブをBSL2フードに戻し、各チューブに1 mLの染色バッファーを加えます。 次に、チューブを170 x g で4°Cで5〜10分間遠心分離します。 遠心分離後、細胞を入れたキャップ付きチューブをBSL2フードに戻し、上清を吸引します。相互汚染を防ぐために、各チューブ間の吸引ピペットの先端を必ず交換してください。 細胞ペレットを1 mLの染色バッファーに再懸濁し、チューブの底をフリックして混合します。 手順8.1.4〜8.1.7を繰り返して、細胞をさらに2回洗浄します。注:細胞の損失を防ぐため、ピペットを使用して再懸濁しないでください。 フローサイトメトリー前の最終再懸濁のために、500 μLの染色バッファーに再懸濁します。メーカーの推奨に従って、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)または死細胞識別器を追加します。 フローサイトメーター機械をセットアップしたら、コントロールとFMOを使用して補正とゲートを設定します。ハンクの平衡塩溶液(HBSS)をシース液として使用して、壊れやすい細胞をサポートします。HBSS が使用できない場合は、PBS を使用します。注意: 使用したフローサイトメーターとソフトウェアは、 材料の表に記載されています。 サンプルを一度に 1 つずつ読み込み、50,000、100,000、500,000、および 100 万のイベントのデータ ポイントを収集します。チューブは氷の上に置くか、使用するまで冷蔵してください。注:サンプルの生存率を確保するために、収集時に時間制限を設定できます。 細胞を15 mLの遠沈管で10Sで3 mLのRPMIに集めます。 EpCAM+細胞に対して免疫蛍光を行う場合は、フローサイトメーターを使用して、8ウェルスライドの各ウェルに800〜1,000個の細胞を分類します。 EpCAM-細胞集団を、免疫蛍光の染色時に使用するネガティブコントロールとして別々のスライドに分類します。注:細胞はFBSを含む15 mLチューブに分類し、細胞遠心分離機またはピペットを使用してスライド上にスピンして、細胞が飛び出すのを防ぐこともできます。 スライドを50%メタノール/50%アセトン混合液に-20°Cで10分間固定します。スライドを免疫蛍光で染色するまで-20°Cで保存します。 フローサイトメトリー解析ライセンスを受けたフローサイトメトリー解析ソフトウェアを開きます。 フローサイトメトリーから取得した標準(FCS)ファイルをコントロールおよびサンプルとともにロードします。 [ グループの作成 ] をクリックし、キーワードを使用してサンプルとコントロールをグループに配置します。注: 図3に示すように、「染色なし」コントロールを使用して、フローサイトメトリー分析ソフトウェアをゲートします。 染色コントロールなしサンプルをダブルクリックして、未 染色 のグラフを開きます。 グラフのy軸をSSC-Aに、x軸をFSC-A(前方散乱面積による側面散乱領域)に設定し、セルサイズと内部の複雑さを示します。 左上のパネルのポリゴン形状をクリックして、セルの周囲にゲートを作成します。周辺のセルは破片である可能性が高いため、必ず除外してください。 図 3A に示すように、このゲートに「セル」というラベルを付けます。 セルがゲートされたら、ポリゴン形状の内側をダブルクリックして、新しいウィンドウで別のグラフを開きます。 ダブレット識別のために、新しいグラフのy軸をSSC-Aに、x軸をSSC-Wに設定します。多角形をクリックし、単一セルの周囲に四角形を作成します。 図 3B に示すように、この “単一セル” というラベルを付けます。 セルがゲートされたら、ポリゴン形状の内側をダブルクリックして、新しいウィンドウで別のグラフを開きます。 y軸をFSC-Aに、x軸をDAPI-A(または使用する死細胞識別器)に設定します。 グラフの左側にある DAPI 負のセルの周囲にポリゴン ゲートを作成します。 図3Cに示すように、これらの「生細胞」を標識します。 セルがゲートされたら、ポリゴン形状の内側をダブルクリックして、新しいウィンドウで別のグラフを開きます。 y軸をSSC-Aに、x軸をEpCAM-PE(またはEpCAM細胞の同定に使用される蛍光色素)に設定します。左側のセルはEpCAM陰性です。右側にセルが表示されている場合、それらはEpCAM陽性です。 EpCAM-PE グラフを使用して、左側のセルを除外し、右側の空のスペースのみを含むポリゴン ゲートを作成します。 図 3D に示すように、ポリゴン内の右側の空の領域に「EpCAM」というラベルを付けます。注:これは染色コントロールではないため、EpCAM発現があってはなりません。染色なしコントロールを使用して、どの細胞がEpCAM陽性であるかを判断します。これで補正のゲーティング戦略は完了するため、この時点ですべてのグラフを閉じることができます。 ワークスペースページで、「細胞」、「単一細胞」、「生細胞」、および「EpCAM」で染色なしの系統を強調表示します。右クリックして、[ 分析をグループにコピー]を選択します。これにより、以前に作成したグループ内の他のすべてのロードされたサンプルにゲーティング戦略がコピーされます。グループが最初に作成されていない場合は、左上の [ グループの作成 ] を選択して今すぐ作成できます。 グループ内のサンプルを確認し、前に描画したポリゴン ゲートをチェックして、すべてのサンプルとコントロールに適合していることを確認します。これにより、セルのパーセンテージ数と数が提供されます。 「ワークスペース」の上の左上隅にあるレイアウトエディターボタン L をクリックします。これらのグラフは、レイアウトエディタを使用して配置およびエクスポートできます。 免疫蛍光試薬の調製ウシ血清アルブミン(BSA)1 g、脱脂乳2 g、10 mLの10xトリス緩衝生理食塩水(TBS)、100 μLのトゥイーン、および90 mLの蒸留水を組み合わせて抗体希釈液を調製します。 50 mLの20x TBS、950 mLの蒸留水、および200 μLのトゥイーンを組み合わせてTBSTを調製します。 1 mLのNHSと9 mLの抗体希釈液を組み合わせて、10%正常馬血清(NHS)を調製します(ステップ8.4.1)。 1 mLの10%NHSと9 mLのTBSTを組み合わせて、1%NHSを調製します。 免疫蛍光染色スライドを-20°Cから取り外し、室温まで温めます。 スライドを蒸留水でそれぞれ5分間3回洗います。 抗体希釈液中の10%NHS中で室温で1時間スライドをブロックします(ステップ8.4.3)。 一次抗体(パンサイトケラチン)をTBST中の1%NHSで1:750に希釈します(ステップ8.4.4)。希釈した一次抗体でスライドを4°Cで一晩インキュベートします。 翌日、スライドを1x洗浄バッファー(PBSまたはTBST)でそれぞれ5分間3回洗浄します。 二次抗体をTBSTの1%NHSで1:1,000に希釈します(ステップ8.4.4)。希釈した二次抗体中でスライドを室温で1時間インキュベートします。 スライドを1x洗浄バッファーでそれぞれ5分間3回洗浄します。DAPI を使用して、ハードセットのマウント メディアでスライドをマウントしてカバースリップします。綿棒を使用して、カバーガラスの下に泡をそっと広げます。