Evidenz für EpCAM und Zytokeratin-exprimierende Epithelzellen in normalem menschlichem und murinem Blut und Knochenmark
Summary
In dieser Arbeit wird eine reproduzierbare Methode mit neuen Erkenntnissen über das Vorhandensein von Epithelzellen in normalem Blut und Knochenmark von Mensch und Maus mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Krt1-14;mTmG transgene Mäuse wurden als in vivo Methode verwendet, um diese Ergebnisse zu bestätigen.
Abstract
Epithelzellen wurden im Blut und Knochenmark von Patienten mit Krebs und anderen Krankheiten identifiziert. Das Vorhandensein normaler Epithelzellen im Blut und Knochenmark gesunder Personen muss jedoch noch auf konsistente Weise nachgewiesen werden. Hier wird eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Epithelzellen aus gesundem menschlichem und murinem Blut und Knochenmark (BM) mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzmikroskopie (IF) vorgestellt. Epithelzellen von gesunden Individuen wurden zunächst mittels Durchflusszytometrie mit Hilfe von Epithelzelladhäsionsmolekülen (EpCAM) identifiziert und isoliert. Diese EpCAM+-Zellen exprimieren Keratin mittels Immunfluoreszenzmikroskopie in Krt1-14;mTmG-transgenen Mäusen. Humane Blutproben wiesen 0,18% ± 0,0004 EpCAM+ Zellen auf (REM; n=7 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate). Im humanen BM waren 3,53% ± 0,006 (REM; n=3 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate) der mononukleären Zellen EpCAM+. Im Blut der Maus machten die EpCAM+-Zellen 0,45 % ± 0,0006 (REM; n = 2 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate) aus, und im BM der Maus waren 5,17 % ± 0,001 (REM; n = 3 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate) EpCAM+. In Mäusen waren alle EpCAM+-Zellen immunreaktiv gegenüber Pan-Zytokeratin, wie durch IF-Mikroskopie festgestellt wurde. Die Ergebnisse wurden anhand von Krt1-14;mTmG-transgenen Mäusen bestätigt, wobei eine geringe Anzahl (8,6 native GFP+-Zellen pro 106 analysierte Zellen; 0,085 % der lebensfähigen Zellen), aber eine signifikante Anzahl (p < 0,0005) von GFP+-Zellen in normaler muriner BM vorhanden war, die im Vergleich zu mehreren Negativkontrollen nicht das Ergebnis von Zufälligkeit waren. Darüber hinaus waren EpCAM+-Zellen im Mausblut heterogener als CD45+-Zellen (0,58% im BM; 0,13% im Blut). Diese Beobachtungen schlussfolgern, dass Zellen, die Zytokeratinproteine exprimieren, reproduzierbar zwischen mononukleären Zellen aus menschlichem und murinem Blut und BM nachweisbar sind. Wir demonstrieren eine Methode der Gewebegewinnung, Durchflusszytometrie und Immunfärbung, mit der die Funktion dieser Pan-Zytokeratin-Epithelzellen bei gesunden Personen identifiziert und bestimmt werden kann.
Introduction
Epithelzellen befinden sich in den physischen Barrieren zwischen unserem Körper und der Umwelt und sind in der Lage, Veränderungen in ihrer Mikroumgebung zu erkennen und darauf zu reagieren1. Sie haben eine proliferierende Stammzellnische, die eine Möglichkeit bietet, neues Gewebe umzudrehen und Schäden zu reparieren2. Unser Labor untersucht Stammzellen in den Haarfollikeln der Haut; Die Haut ist ein gutes Modell für die Untersuchung der Proliferation von Epithelgewebe und Stammzellen, da sie leicht sichtbar ist und ein ständiger Zellumsatz stattfindet. Epithelkarzinome sind die häufigste Krebsform, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass Epithelgewebe wie die Haut die erste Verteidigungslinie gegen Umweltkarzinogene sind, was zu hohen Umsatzraten und der Vermehrung von Epithelzellen führt3. Der größte Teil der Epidermis der Haut, die oberste Schutzschicht, besteht aus Keratinozyten, die verschiedene Arten von Keratinen exprimieren, um Halt und Struktur zu bieten4. Patienten mit Epithelkarzinomen haben oft Epithelzellen im Blut und Knochenmark, die ebenfalls Keratine exprimieren. Flüssigbiopsien sind eine nicht-invasive Methode, um diese Epithelzellen in verschiedenen Körperflüssigkeiten nachzuweisen und zu überwachen5. Zirkulierende Epithelzellen, auch zirkulierende Tumorzellen (CTCs) genannt, kommen im peripheren Blut vor und können Biomarker für die Krebsprognose sein und individualisierte Therapien steuern. CTCs können auch Aufschluss über das Fortschreiten der Erkrankung, die Wirksamkeit der Behandlung und das Gesamtüberleben der Patienten geben 5,6.
Das Epithelzelladhäsionsmolekül (EpCAM) ist ein klinisch verwendeter Marker für CTCs und kann Tumore epithelialen Ursprungs bei Krebspatienten identifizieren. EpCAM spielt eine Rolle bei der Zelladhäsion, -migration, -signaltransduktion, -proliferation und -differenzierung6. Damit eine zirkulierende Epithelzelle als CTC klassifiziert werden kann, muss sie positiv für die Zytokeratine 8, 18 und 19 und negativ für CD45, einen häufigen Leukozytenmarker6, sein. CTCs werden in der Regel identifiziert, indem zuerst CD45 mit magnetischen Mikrokügelchen depletiert wird, gefolgt von einem Test auf EpCAM und Cytokeratin 19 mittels Immunfluoreszenzmikroskopie7. Die Haupteinschränkung bei der Erkennung von CTCs ist ihre Seltenheit; Sie machen weniger als 0,01 % aller Zellen im Blut aus, und nur sehr wenige überleben im Blutkreislauf, um entfernte Organe zu erreichen 8,9,10. Bei der Planung von Experimenten und Techniken zur Isolierung und Identifizierung dieser Zellen muss aufgrund ihrer seltenen Natur berücksichtigt werden. Derzeit gibt es nur einen von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen automatisierten Einzelzellsortierer, der zur Identifizierung von CTCs verwendet wird und EpCAM als Biomarker verwendet. Andere Methoden sind die magnetische Bead-Trennung und die Durchflusszytometrie oder eine Kombination dieser Methoden. Es besteht ein Bedarf an neuen Techniken, die eine höhere Sensitivität und Spezifität für den Nachweis seltener CTCs aufweisen11.
Die Durchflusszytometrie ist eine bevorzugte Methode zum Nachweis seltener Zellpopulationen im Blut, Knochenmark und anderen Gewebeproben. Zu diesen seltenen Zellen können Stammzellen, zirkulierende Endothelzellen, CTCs und Krankheitsrestzellen gehören. Die Durchflusszytometrie ermöglicht quantitative Messungen jedes Zelltyps und sortiert diese Zellen für weitere Tests 7,9. Es wurden inkrementelle Zählungen durchgeführt, um eine genaue Beurteilung dieser seltenen Zellen zu gewährleisten. Die Möglichkeit, Zellen mithilfe von Gating von der weiteren Analyse auszuschließen, ist eine Möglichkeit, die Spezifität bei der Analyse von Zellen zu erhöhen. Die Einschränkungen der Durchflusszytometrie sind der Zeitaufwand für die Analyse großer Proben und das Fehlen einer visuellen Bestätigung der Zellidentität. Um dies zu überwinden, wurde eine Immunfluoreszenzmikroskopie an den sortierten Zellen durchgeführt, um ihre Identität zu bestätigen.
Zuvor hat unser Labor gezeigt, dass bei Mäusen die Knochenmarkszellen rekrutiert werden und zu Hauttumoren beitragen12. Diese aus dem Knochenmark stammenden Zellen sind positiv für Pan-Zytokeratin und epidermales Zytokeratin. Um die Rolle von epithelialen Stammzellen, aus dem Knochenmark stammenden Zellen und Zytokeratin-exprimierenden Zellen bei der Tumorprogression weiter aufzuklären, wurde nach EpCAM+-Zytokeratin-positiven Zellen in normalen murinen und menschlichen Blut- und Knochenmarkproben gesucht. Wie bei den meisten Experimenten wurde auch diese Methode durch mehrere Iterationen entwickelt. Bisher wurden transgene Mäuse zusammen mit inkrementellen Zählungen verwendet, um nach K14GFP-exprimierenden Zellen im Knochenmark zu suchen12. Je mehr Zellen gezählt wurden, desto mehr konnte eine repräsentative Population seltener Zellen identifiziert werden, wie in Abbildung 1 im Abschnitt “Repräsentative Ergebnisse” dargestellt. Die Begründung für die Untersuchung von Epithelzellen in normalem Blut und Knochenmark basierte auf der frühen Literatur zu CTCs, bei denen normale gesunde Spender Hintergrundspiegel von EpCAM+-Zellen aufwiesen13. Wie bereits erwähnt, beginnt die EpCAM-Charakterisierung oft mit der Depletion von CD45. Dieser Schritt wurde ausgelassen, da einige hämatopoetische Zellen aus unbekannten Gründen, die weiter untersucht werden müssen, eine EpCAM- und Zytokeratin-Expression aufweisen. Daher wurden die Zellen unabhängig von der Zelllinie nach dem Vorhandensein oder Fehlen von EpCAM sortiert und dann auf Zytokeratin immungefärbt. Das nachstehende Protokoll und der in Abbildung 2 gezeigte Arbeitsablauf beschreiben eine Technik, die Durchflusszytometrie mit Kompensation und Kontrollen, statistische Methoden und Immunfluoreszenzbildgebung verwendet, um diese seltenen Populationen von Epithelzellen zu isolieren und zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Literatur gibt es einige Hinweise auf das Vorhandensein von Epithelzellen im Knochenmark. Bisher wurde in der Regel die Rolle von Epithelzellen im Zusammenhang mit Krankheiten und Verletzungen untersucht, z. B. in Leber, Lunge, Magen-Darm-Trakt, Thymusdrüse und Haut14,15,16,17. Über das Vorkommen dieser Epithelzellen im Knochenmark gesunder Personen ist jedoch nicht viel bekannt. Ziel dieser Arbeit ist es, eine reproduzierbare Methode zu etablieren, mit dem Ziel, Epithelzellen aus normalem Blut und Knochenmark zu identifizieren und zu isolieren. Diese Methode wird das Feld vorantreiben, um herauszufinden, warum Epithelzellen vorhanden sind und welche Rolle sie im Blut und Knochenmark spielen, wenn keine Krankheit vorliegt. Möglicherweise sind diese Zellen Teil der normalen Gewebeerhaltung oder werden bei Verletzungen aktiviert. Das Knochenmark ist ein Speicher für Stammzellen. Es ist jedoch unklar, was die Abstammung dieser Epithelzellen sein könnte. In einer kürzlich erschienenen Arbeit werden aus dem Knochenmark stammende Epithelzellen im Thymus diskutiert, die zunächst EpCAM und den hämatopoetischen Marker CD45 exprimieren und dann nach einer Verletzung im Laufe der Zeit ihre CD45-Expression verlieren15. Untersuchungen aus unserem Labor haben auch das Vorhandensein von CD45+ EpCAM+-Zellen in gesundem Blut und Knochenmark bestätigt, wenn keine Verletzung vorliegt12. Die Rolle dieser Zellen muss jedoch noch geklärt werden.
Es bestand Bedarf an einer reproduzierbaren Methode zur Untersuchung von Epithelzellen im gesunden Knochenmark. Die beschriebene Methode wird helfen, diese Zellen in ihrem Normalzustand weiter zu charakterisieren. Es gibt wichtige Schritte in dieser Methode, um die Reproduzierbarkeit zu erhalten. Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist die Aufrechterhaltung einer sterilen Umgebung in der Haube bei der Entnahme des Knochenmarks von Mäusen. Bei der Ernte von mehreren Mäusen wird eine Kreuzkontamination zwischen den Proben vermieden, indem für jede Maus neue Nadeln und Spritzen verwendet werden. Dadurch wird auch sichergestellt, dass die Probe sauber und frei von Verunreinigungen ist, die die Ergebnisse beeinträchtigen könnten. Darüber hinaus sollte die Anzahl der vorbereiteten Spritzen und beschrifteten konischen Röhrchen für jede weitere Maus erhöht werden. Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, die Knochen zu spülen, bis eine saubere weiße Farbe sichtbar ist, um sicherzustellen, dass die meisten Knochenmarkzellen entfernt wurden. Die Chancen, seltene Zellen zu erkennen, erhöhen sich in einer reineren Probe. Es wurde eine Modifikation vorgenommen, um das Protokoll zur Lyse der roten Blutkörperchen zu optimieren. Es wurden mehrere Lysepuffer getestet, um den richtigen zu finden, der eine gleichbleibend hohe Viabilität lieferte, da fast die Hälfte der Zellen während dieses Schritts verloren ging. Unterschiedliche Reagenzien und Inkubationszeiten müssen möglicherweise optimiert werden, um in anderen Umgebungen bessere Ergebnisse zu erzielen.
Die bedeutendste Einschränkung dieses Protokolls ist die Verwendung der Durchflusszytometrie zum Auffinden seltener Zellpopulationen. Wie bereits erwähnt, trägt das Hinzufügen von Kontrollen und inkrementellen Zählungen dazu bei, die Spezifität und Genauigkeit der Analyse zu erhöhen. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass geeignete Marker für die interessierende Population im Voraus identifiziert werden müssen. Daher muss man über wichtige Marker, Antikörper für die Durchflusszytometrie und Antikörper, die mit der Zielspezies kompatibel sind, Bescheid wissen.
Diese Methoden stellen eine Verbesserung gegenüber bestehenden Methoden dar, da sie die Einzelzellanalyse zu einem Bruchteil der Kosten des bestehenden automatischen CTC-Isolators und der Einzelzell-RNA-Sequenzierung ermöglichen. Darüber hinaus ist die Durchflusszytometrie leichter verfügbar. FACS behielt eine höhere Viabilität der Zellen im Vergleich zu früheren berichteten Ergebnissen unter Verwendung der magnetischen Mikroperlentrennung bei. Schließlich ermöglichen diese Techniken die Trennung von Zellen für nachgelagerte Analysen, wie z. B. die Bulk-RNA-Sequenzierung, die scRNA-Sequenzierung oder die Zellkultur.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Josh Monts, Durchflusszytometer-Techniker der Core Facility, Hormel Institute
Todd Schuster, Core Facility Manager, The Hormel Institute
Derek Gordon, Statistiker, Rutgers University
Wir bedanken uns bei Karen Klein von Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM für ihre redaktionelle Unterstützung.
Diese Arbeit wurde teilweise vom National Institute of Arthritis and Muskuloskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health unter der Fördernummer R21 AR075281 und einem Grant-in-Aid of Research, Artistry and Scholarship, Office of the Vice President for Research, University of Minnesota (Vorschlag #324240) unterstützt. Wir bedanken uns für die Unterstützung durch das Hormel Institute.
Materials
| 40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
| 500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
| 190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
| Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
| Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
| Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
| Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
| Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
| Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
| Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
| Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
| Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
| Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
| PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1×106 cells |
| PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1×106 cells |
| PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
| PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1×106 cells |
| PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells |
| Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
| Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
| PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
| PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
| PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
| RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
| Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
| Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
| Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
| StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
| Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
| TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
| Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
| Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |
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