JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Bewijs voor EpCAM en cytokeratine die epitheelcellen tot expressie brengen in normaal menselijk en muizenbloed en beenmerg

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/65118
, ,
1The Hormel Institute,University of Minnesota

Summary

Dit artikel presenteert een reproduceerbare methode met nieuwe bevindingen over de aanwezigheid van epitheelcellen in normaal menselijk en muisbloed en beenmerg met behulp van flowcytometrie en immunofluorescentiemicroscopie. Krt1-14;mTmG transgene muizen werden gebruikt als een in vivo methode om deze bevindingen te bevestigen.

Abstract

Epitheelcellen zijn geïdentificeerd in het bloed en beenmerg van patiënten met kanker en andere ziekten. De aanwezigheid van normale epitheelcellen in het bloed en beenmerg van gezonde personen moet echter nog op een consistente manier worden geïdentificeerd. Hier wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd voor het isoleren van epitheelcellen uit gezond menselijk en muizenbloed en beenmerg (BM) met behulp van flowcytometrie en immunofluorescentie (IF) microscopie. Epitheelcellen bij gezonde personen werden voor het eerst geïdentificeerd en geïsoleerd via flowcytometrie met behulp van epitheliale celadhesiemolecuul (EpCAM). Van deze EpCAM+ cellen werd bevestigd dat ze keratine tot expressie brengen met behulp van immunofluorescentiemicroscopie in Krt1-14;mTmG transgene muizen. Menselijke bloedmonsters hadden 0,18% ± 0,0004 EpCAM+ cellen (SEM; n=7 biologische replicaties, 4 experimentele replicaties). In humane BM waren 3,53% ± 0,006 (SEM; n=3 biologische replicaties, 4 experimentele replicaties) van mononucleaire cellen EpCAM+. In muizenbloed vormden EpCAM+-cellen 0,45% ± 0,0006 (SEM; n=2 biologische replicaties, 4 experimentele replicaties) en in muis-BM waren 5,17% ± 0,001 (SEM; n=3 biologische replicaten, 4 experimentele replicaten) EpCAM+. Bij muizen waren alle EpCAM+ cellen immunoreactief tot pan-cytokeratine, zoals bepaald door IF-microscopie. De resultaten werden bevestigd met behulp van Krt1-14;mTmG transgene muizen, met lage (8,6 native GFP+ cellen per 106 geanalyseerde cellen; 0,085% van de levensvatbare cellen), maar significante aantallen (p < 0,0005) van GFP+ cellen aanwezig in normale murine BM, die niet het resultaat waren van willekeur in vergelijking met meerdere negatieve controles. Verder waren EpCAM+-cellen in muizenbloed heterogener dan CD45+-cellen (0,58% in BM; 0,13% in bloed). Deze waarnemingen concluderen dat cellen die cytokeratine-eiwitten tot expressie brengen, reproduceerbaar detecteerbaar zijn tussen mononucleaire cellen uit menselijk en muizenbloed en BM. We demonstreren een methode van weefseloogst, flowcytometrie en immunostaining die kan worden gebruikt om de functie van deze pancytokeratine-epitheelcellen bij gezonde personen te identificeren en te bepalen.

Introduction

Epitheelcellen worden gevonden in de fysieke barrières tussen ons lichaam en de omgeving en zijn in staat om veranderingen in hun micro-omgeving te herkennen en erop te reageren1. Ze hebben een prolifererende stamcelniche die een manier biedt om nieuw weefsel om te keren en schadete herstellen 2. Ons lab bestudeert stamcellen in de haarzakjes van de huid; De huid is een goed model voor het bestuderen van epitheelweefsel en stamcelproliferatie omdat het gemakkelijk zichtbaar is en er een constante omzet van cellen is. Epitheelkankers zijn de meest voorkomende vorm van kanker, mogelijk als gevolg van epitheliale weefsels, zoals de huid, die de eerste verdedigingslinie zijn tegen kankerverwekkende stoffen in het milieu, wat leidt tot hoge omloopsnelheden en de proliferatie van epitheelcellen3. Het grootste deel van de huid epidermis, de bovenste beschermende laag, is samengesteld uit keratinocyten, die verschillende soorten keratines tot expressie brengen om ondersteuning en structuur te bieden4. Patiënten met epitheliale kankers hebben vaak epitheelcellen in hun bloed en beenmerg die ook keratines tot expressie brengen. Vloeibare biopsieën zijn een niet-invasieve manier om deze epitheelcellen in verschillende lichaamsvloeistoffen te detecteren en te controleren5. Circulerende epitheelcellen, ook wel circulerende tumorcellen (CTC’s) genoemd, worden aangetroffen in perifeer bloed en kunnen biomarkers zijn voor de prognose van kanker, evenals begeleide geïndividualiseerde therapiebehandelingen. CTC’s kunnen ook wijzen op ziekteprogressie, werkzaamheid van de behandeling en algehele overleving van de patiënt 5,6.

Epitheelceladhesiemolecuul (EpCAM) is een klinisch gebruikte marker voor CTC’s en kan tumoren van epitheliale oorsprong bij kankerpatiënten identificeren. EpCAM speelt een rol bij celadhesie, migratie, signalering, proliferatie en differentiatie6. Om een circulerende epitheelcel te classificeren als een CTC, moet deze positief zijn voor cytokeratines 8, 18 en 19 en negatief voor CD45, een veel voorkomende leukocytenmarker6. CTC’s worden meestal geïdentificeerd door eerst CD45 uit te putten met magnetische microbeads, gevolgd door testen op EpCAM en cytokeratine 19 met behulp van immunofluorescentiemicroscopie7. De belangrijkste beperking bij de detectie van CTC’s is hun zeldzaamheid; Ze vormen minder dan 0,01% van alle cellen in het bloed en zeer weinig overleven in circulatie om verre organen 8,9,10 te bereiken. Bij het ontwerpen van experimenten en technieken moet rekening worden gehouden met het ontwerpen van experimenten en technieken om deze cellen te isoleren en te identificeren vanwege hun zeldzame aard. Momenteel is er slechts één door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde geautomatiseerde eencellige sorteerder die wordt gebruikt voor het identificeren van CTC’s en deze gebruikt EpCAM als biomarker. Andere methoden zijn magnetische kraalscheiding en flowcytometrie, of een combinatie van deze methoden. Er is behoefte aan nieuwe technieken met een hogere sensitiviteit en specificiteit voor de detectie van zeldzame CTC’s11.

Flowcytometrie is een voorkeursmethode voor de detectie van zeldzame celpopulaties in het bloed, beenmerg en andere weefselmonsters. Deze zeldzame cellen kunnen stamcellen, circulerende endotheelcellen, CTC’s en resterende ziektecellen omvatten. Flowcytometrie maakt kwantitatieve metingen van elk celtype mogelijk en sorteert deze cellen voor verdere tests 7,9. Incrementele tellingen werden uitgevoerd om een nauwkeurige beoordeling van deze zeldzame cellen te garanderen. De mogelijkheid om gating te gebruiken om cellen uit te sluiten van verdere analyse is een manier om de specificiteit te vergroten bij het analyseren van cellen. De beperkingen van flowcytometrie zijn de tijd die nodig is voor de analyse van grote monsters en het ontbreken van visuele bevestiging voor celidentiteit. Om dit te ondervangen, werd immunofluorescentiemicroscopie uitgevoerd op de gesorteerde cellen om hun identiteit te bevestigen.

Eerder heeft ons lab aangetoond dat bij muizen de beenmergcellen worden gerekruteerd en bijdragen aan huidtumoren12. Deze van beenmerg afgeleide cellen zijn positief voor pan-cytokeratine en epidermale cytokeratine. Om de rol van epitheelstamcellen, van beenmerg afgeleide cellen en cytokeratine-tot expressie brengende cellen in tumorprogressie verder op te helderen, werd gezocht naar EpCAM + cytokeratine-positieve cellen in normale muizen- en menselijke bloed- en beenmergmonsters. Zoals met de meeste experimenten, werd deze methode ontwikkeld door middel van meerdere iteraties. Eerder werden transgene muizen samen met incrementele tellingen gebruikt om te zoeken naar K14GFP-tot expressie brengende cellen in het beenmerg12. Naarmate er meer cellen werden geteld, kon een representatieve populatie van zeldzame cellen worden geïdentificeerd, zoals weergegeven in figuur 1 in de sectie representatieve resultaten. De reden voor het onderzoeken van epitheelcellen in normaal bloed en beenmerg was gebaseerd op vroege literatuur over CTC’s, waar normale gezonde donoren achtergrondniveaus van EpCAM + -cellen hadden13. Zoals eerder vermeld, begint EpCAM-karakterisering vaak met de uitputting van CD45. Deze stap werd weggelaten omdat sommige hematopoëtische cellen EpCAM- en cytokeratine-expressie hebben om onbekende redenen die verder moeten worden onderzocht. Daarom werden cellen gesorteerd op basis van de aan- of afwezigheid van EpCAM, ongeacht de cellijn, en vervolgens immunogekleurd voor cytokeratine. Het onderstaande protocol en de workflow in figuur 2 beschrijven een techniek die flowcytometrie gebruikt met compensatie en controles, statistische methoden en immunofluorescentiebeeldvorming om deze zeldzame populaties van epitheelcellen te isoleren en te identificeren.

Protocol

Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door de University of Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee in overeenstemming met NIH en federale richtlijnen. Vers menselijk bloed en beenmerg werden gekocht van commerciële bronnen. Monsters werden verzameld door het bedrijf onder een goedgekeurd IRB-protocol van donoren die negatief waren voor HIV, Hepatitis B, Hepatitis C en gescreend op COVID-19. Alle monsters werden eerst gedeïdentificeerd en geanonimiseerd voordat ze door het bedrijf werden verzonden. Aangezien deze commercieel werden verkregen, was er geen IRB-goedkeuring vereist. 1. Bereiding van oplossingen OPMERKING: Alle oplossingen moeten worden bereid in een biologische kap met een steriele omgeving. Verkrijg bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) certificering voor het werken met menselijk bloed en beenmerg. Bereid beenmergoogstoplossing door 1 ml gentamicine en 5 ml foetaal runderserum (FBS) toe te voegen aan 500 ml Hank’s balanszoutoplossing (HBSS). Bereid de kleuringsbufferoplossing door 50 ml FBS toe te voegen aan 500 ml HBSS. Bereid 1x lysisbuffer door 10 ml 10x lysisbuffer te combineren met 90 ml steriel water. 2. De kap voorbereiden Zet de kap aan en laat hem een paar minuten draaien om een goede luchtstroom te verkrijgen. Verzamel alle materialen om beenmergoogst uit te voeren. Spuit ze in de kap met 70% ethanol om een steriele omgeving te behouden. Spuit de handen elke keer voordat ze in de capuchon worden genomen. Plaats de geautoclaveerde lade in de kap samen met een autoclaafschaar, een geassembleerd scalpel, een pincet en een gebogen tang in een klein kopje gevuld met 70% ethanol om ze steriel te houden. Voeg 10 ml beenmergoogstoplossing toe aan een centrifugebuis van 50 ml en label deze als “Ledemaat”. Label nog een centrifugebuis van 50 ml als “Beenmerg”. Zuig 10 ml beenmergoogstoplossing op in een spuit en bevestig vervolgens een naald van 26 G. 3. Beenmerg oogsten van muizen Euthanaseer de muis met behulp van CO 2-verstikking. De dood wordt bevestigd door de afwezigheid van een hartslag en het knijpen van de voeten om ervoor te zorgen dat er geen reactie is. Cervicale dislocatie kan worden uitgevoerd als een secundair middel voor volledige euthanasie. Plaats de muis in een container van 500 ml en voeg voldoende jodium toe om de helft van de muis te bedekken. Schud en draai de container voorzichtig rond om een grondige dekking te garanderen. Afspoelen met gedeïoniseerd water. Voer nog een jodiumwas uit en vervolgens twee wasbeurten met 70% ethanol volgens dezelfde stappen. Plaats de muis in de kap en leg hem op zijn rug op de lade. Pak de achterpoten vast en trek ze uit elkaar tot er een plof wordt gevoeld; Dit is om de benen van de wervelkolom te scheiden. Maak een incisie van 1 cm op de huid van de muis in de buurt van de liesstreek. Steek een gesloten schaar in de incisie en open vervolgens de schaar onder de huid om deze van het buikvlies te scheiden. Snijd de huid op het been rond de dij en snijd vervolgens de huid langs het been om de spieren en botten bloot te leggen. Verwijder de achterpoten door rond het heupgewricht te snijden, zorg ervoor dat u niet door het dijbeen snijdt. Plaats de ledematen in de buis met het label “Ledematen” Wanneer beide poten zijn verwijderd, plaatst u de muis in een karkaszak en plaatst u deze in de vriezer.OPMERKING: Het heupbot moet eerst worden gevoeld voordat u snijdt om de schaar te begeleiden en te voorkomen dat het dijbeenbot wordt doorgesneden, omdat het grootste deel van het beenmerg uit het dijbeen wordt verkregen. Begin met het wegknippen van de spieren, het weefsel en het vet langs een van de ledematen met behulp van de schaar. Snijd evenwijdig aan het bot. Gebruik vervolgens het scalpel en verwijder het resterende vet of de spier, met behulp van een loodrechte schraapbeweging tegen het bot. Zodra het bot goed is schoongemaakt, scheidt u het dijbeen en het scheenbeen bij de knie. Gebruik het scalpel om sneden te maken aan beide uiteinden van het dijbeen en het scheenbeen waar geen zichtbaar beenmerg is. Steek de voorbereide spuit en naald in het bot. Als er weerstand is, snijd dan iets meer van het uiteinde van het bot af totdat er geen weerstand meer is.Terwijl u het bot boven de buis houdt met het label “Beenmerg”, verdrijft u de beenmergoogstoplossing door het bot om het beenmerg in de buis te spoelen. Herhaal dit aan het andere uiteinde van het bot om de rest van het beenmerg te verkrijgen, totdat het bot helemaal wit of leeg lijkt. Herhaal stap 7-9 voor alle resterende botten en ledematen; Al het merg wordt in dezelfde conische buis gespoeld. Gebruik een lege spuit van 10 ml en een naald van 20 G om de klonten beenmerg in de buis te breken door het beenmerg 5-10 keer op en neer te trekken in de spuit. Voeg een steriel filter van 40 μm toe aan een schone centrifugebuis van 50 ml en spoel deze af met 1 ml beenmergoogstoplossing. Filter vervolgens het beenmerg om eventuele resterende klonten te verwijderen. Label deze buis “Gefilterd beenmerg”. Bewaar het gefilterde beenmerg in de koelkast of op ijs tot gebruik. Het moet op dezelfde dag van oogst worden gebruikt. Als het niet op dezelfde dag wordt gebruikt, bevries dan de cellen met een cryoconserveermiddel, zoals dimethylsulfoxide (DMSO).LET OP: Al het afval van deze experimenten moet op de juiste manier worden weggegooid in een biohazard afvalcontainer. Alle scherpe punten moeten in een goed gelabelde biohazard naaldencontainer gaan. 4. Rode bloedcellyse van beenmerg Centrifugeer de beenmergcellen op 170 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Stofzuig en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in 10 ml 1x rode bloedcellen lysisbuffer en incubeer gedurende 4 min. Voeg 30 ml Dulbecco’s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) toe om de reactie van de lysisbuffer te stoppen. Centrifugeer de cellen gedurende 8 minuten bij 170 x g bij kamertemperatuur. Stofzuig en gooi het supernatant weg. Resuspendie in 10-20 ml kleuringsbuffer. 5. Aantal cellen Combineer 500 μl cellen met 9,5 ml beenmergoogstoplossing om een verdunning van 1:20 te verkrijgen.OPMERKING: Dit wordt gebruikt voor celtellingen en hoeft niet steriel te worden gehouden. Trek 200 μL cellen uit de 1:20 verdunning, voeg ze toe aan 200 μL trypan blauw en meng goed. Voeg het mengsel toe aan een hemocytometer en tel de levende en dode cellen aan beide zijden. Bereken de oorspronkelijke celschorsing met behulp van deze tabel (weergegeven in Aanvullend bestand 1) en vergelijkingen:Cellen per milliliter:Totaal aantal cellen: Draai de cellen gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 170 x g en resuspensie tot een concentratie van 10 x 10 6 per 1 ml (1 x 106 cellen per 100 μl), op basis van de suggesties van de fabrikant voor antilichaamverdunningen. Ga verder met flowcytometrie (stap 8). 6. Bloed oogsten van muizen Euthanaseer de muis met behulp van CO2-gas of cervicale dislocatie. Voer een hartbloedafname uit in een hoek van 45° met een naald van 26 G bevestigd aan een spuit van 1 ml bedekt met 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Draai het bloed af en resuspensie in media of kleuringsbuffer.OPMERKING: De cellen worden gesponnen en geresuspendeerd tot de uiteindelijke concentratie in de kleuringsbuffer na lyse van rode bloedcellen en celtelling. Voer de rode bloedcellyse uit (stap 4). Voer het celgetal uit (stap 5). Ga verder met flowcytometrie (stap 8). 7. Verwerking van menselijke bloed- en beenmergmonsters Voer alle procedures uit onder een BSL2-gecertificeerde capuchon terwijl u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Verzamel de monsters de vorige nacht en voer rode bloedcellyse uit. Zorg ervoor dat de monsters worden gedeïdentificeerd en geanonimiseerd voordat de mononucleaire monsters ‘s nachts op ijs worden verzonden. Draai bij aankomst de levende cellen gedurende 10 minuten op 170 x g bij 4 °C naar beneden.OPMERKING: Dit zijn BSL2-monsters die aan de lokale richtlijnen moeten voldoen. Suspensie van de cellen in media of kleuringsbuffer.OPMERKING: De cellen moeten worden gesponnen en geresuspendeerd tot de uiteindelijke concentratie na celtelling met kleuringsbuffer. Voer het celgetal uit (stap 5). Ga verder met flowcytometrie (stap 8). 8. Flowcytometrie KleuringVerdeel de cellen in individueel gelabelde buizen op basis van het gebruikte kleurpaneel, inclusief compensatiecontroles (niet-gekleurd, isotypecontroles, enkelkleurig en fluorescentieminussen [FMO’s]). Bevries alle resterende cellen of gebruik ze voor fluorescentie-geactiveerde celsortering. Zie tabel 1 voor een voorbeeld van een kleuringspaneel met de gebruikte antilichaamverdunningen.OPMERKING: Voor elke extra fluorofoor die wordt toegevoegd, moeten FMO’s in combinatie met resterende fluoroforen worden toegevoegd, samen met een enkele kleuring van die fluorofoor. Isotypecontroles kunnen worden gebruikt om niet-specifieke kleuring te blokkeren. Elk nieuw antilichaam dat wordt gebruikt, moet met de monsters worden getitreerd voor een optimale verdunning. Voeg antilichamen toe volgens de door de fabrikant aanbevolen verdunningen en meng goed door de onderkant van de buizen te vegen. Antilichaamconcentraties worden gewoonlijk gegeven als 1 x 106 cellen per 100 μL. Verdunningen met antilichamen en controles zijn weergegeven in tabel 1. Antilichamen worden geconjugeerd met fluoroforen en moeten worden beschermd tegen licht.OPMERKING: Het is het beste om EpCAM geconjugeerd aan fycoerythrin (PE) te gebruiken om lage populaties van cellen te visualiseren (titraat bij 3-5 μL per 1 miljoen cellen, zoals aangegeven in tabel 1). PE-CD49f werd gebruikt als een enkele vlek PE-controle (20 μL per 1 miljoen cellen), omdat deze cellen vaker voorkomen dan PE-EpCAM en dus gemakkelijker te gebruiken zijn voor compensatie. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker. Breng na incubatie de buizen terug naar de BSL2-kap en voeg 1 ml kleurbuffer toe aan elke buis. Centrifugeer vervolgens de buizen op 170 x g bij 4 °C gedurende 5-10 minuten. Breng na het centrifugeren de afgedekte buizen met de cellen terug naar de BSL2-kap en zuig het supernatant eruit. Zorg ervoor dat u de uiteinden van de aspiratiepipet tussen elke buis vervangt om kruisbesmetting te voorkomen. Resuspendeerde de celkorrel in 1 ml kleurbuffer en veeg de onderkant van de buizen om te mengen. Was de cellen nog twee keer door de stappen 8.1.4-8.1.7 te herhalen.OPMERKING: Gebruik geen pipetten om te resuspenderen, om te voorkomen dat cellen verloren gaan. Resuspendie in 500 μL kleuringsbuffer voor de uiteindelijke resuspensie vóór flowcytometrie. Voeg 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) of dode celdiscriminator toe, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. FlowcytometerGebruik na het instellen van de machine de bedieningselementen en FMO’s om de compensatie en poorten in te stellen. Gebruik Hank’s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) als schedevloeistof om de fragiele cellen te ondersteunen. Gebruik PBS als HBSS niet beschikbaar is.OPMERKING: De gebruikte flowcytometer en de software staan vermeld in de materiaaltabel. Laad de monsters één voor één en verzamel gegevenspunten voor 50.000, 100.000, 500.000 en een miljoen gebeurtenissen. Bewaar de tubes op ijs of gekoeld tot gebruik.OPMERKING: Bij het verzamelen kan een tijdslimiet worden ingesteld om de levensvatbaarheid van het monster te garanderen. Verzamel de cellen in 3 ml RPMI met 10% FBS in centrifugebuizen van 15 ml. Als u immunofluorescentie uitvoert op EpCAM+ cellen, gebruik dan de flowcytometer om 800 tot 1.000 cellen in elke put van een 8-well slide te sorteren. Sorteer de EpCAM-celpopulatie op afzonderlijke dia’s als een negatieve controle om te gebruiken bij het kleuren voor immunofluorescentie.OPMERKING: De cellen kunnen ook worden gesorteerd in buizen van 15 ml die FBS bevatten en op een dia worden gesponnen met behulp van de cytocentrifuge of een pipet om te voorkomen dat cellen knallen. Bevestig de glaasjes gedurende 10 minuten in een mengsel van 50% methanol/50% aceton bij -20 °C. Bewaar de dia’s bij -20 °C tot kleuring met immunofluorescentie. Flowcytometrie analyseOpen de gelicentieerde flowcytometrie-analysesoftware. Load flow cytometry standard (FCS) bestanden verkregen van de flowcytometer met controles en monsters. Klik op Groep maken en gebruik trefwoorden om voorbeelden en besturingselementen in een groep te plaatsen.OPMERKING: Gebruik de “no stain”-controle om de flowcytometrie-analysesoftware in te schakelen, zoals weergegeven in figuur 3. Dubbelklik op het voorbeeld zonder vlekcontrole om een niet-geassocieerde grafiek te openen. Stel de grafiek y-as in op SSC-A en x-as op FSC-A (zijverstrooiingsgebied door voorwaarts verstrooiingsgebied), wat de celgrootte en interne complexiteit aangeeft. Klik op de polygoonvorm in het deelvenster linksboven en maak een poort rond de cellen. Zorg ervoor dat u de cellen aan de periferie uitsluit, omdat dit hoogstwaarschijnlijk puin is. Label deze poort “Cellen”, zoals weergegeven in figuur 3A. Zodra de cellen zijn omheind, dubbelklikt u in de polygoonvorm om een andere grafiek in een nieuw venster te openen. Stel de y-as van de nieuwe grafiek in op SSC-A en de x-as op SSC-W voor doubletdiscriminatie. Klik op de polygoonvorm en maak een rechthoek rond de afzonderlijke cellen. Label dit als “Enkele cellen”, zoals weergegeven in figuur 3B. Zodra de cellen zijn omheind, dubbelklikt u in de polygoonvorm om een andere grafiek in een nieuw venster te openen. Stel de y-as in op FSC-A en x-as op DAPI-A (of welke dodeceldiscriminator dan ook wordt gebruikt). Maak een polygoonpoort rond de negatieve DAPI-cellen aan de linkerkant van de grafiek. Label deze “Levende cellen”, zoals weergegeven in figuur 3C. Zodra de cellen zijn omheind, dubbelklikt u in de polygoonvorm om een andere grafiek in een nieuw venster te openen. Stel de y-as in op SSC-A en de x-as op EpCAM-PE (of welke fluorofoor dan ook wordt gebruikt om de EpCAM-cellen te identificeren). Cellen aan de linkerkant zijn EpCAM-negatief. Als er cellen aan de rechterkant worden weergegeven, zijn ze EpCAM-positief. Gebruik de EpCAM-PE-grafiek om een veelhoekpoort te maken, die de cellen aan de linkerkant uitsluit en alleen de lege ruimte aan de rechterkant bevat. Label het lege gebied aan de rechterkant in de veelhoek “EpCAM”, zoals weergegeven in Figuur 3D.OPMERKING: Dit is geen vlekcontrole, dus er mag geen EpCAM-expressie zijn. Gebruik het besturingselement geen vlekken om te bepalen welke cellen EpCAM-positief zijn. Hiermee is de gating-strategie voor compensatie voltooid, dus alle grafieken kunnen op dit moment worden gesloten. Markeer op de werkruimtepagina de afstamming zonder vlekken met “Cellen”, “Enkele cellen”, “Levende cellen” en “EpCAM”. Klik met de rechtermuisknop en selecteer analyse kopiëren om te groeperen. Hiermee wordt de gatingstrategie gekopieerd naar alle andere geladen voorbeelden binnen de eerder gemaakte groep. Als een groep in eerste instantie niet is gemaakt, kunt u deze nu maken door Groep maken linksboven te selecteren. Doorloop de monsters binnen de groep en controleer de eerder getekende polygoonpoorten om er zeker van te zijn dat ze passen bij alle monsters en bedieningselementen. Dit geeft het percentage aantal en het aantal cellen. Klik op de lay-outeditorknop L in de linkerbovenhoek boven “Werkruimte”. Deze grafieken kunnen vervolgens worden gerangschikt en geëxporteerd met behulp van de lay-outeditor. Bereiding van immunofluorescentieragentiaBereid het antilichaamverdunningsmiddel door 1 g runderserumalbumine (BSA), 2 g magere melk, 10 ml 10x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), 100 μL Tween en 90 ml gedestilleerd water te combineren. Bereid TBST door 50 ml 20x TBS, 950 ml gedestilleerd water en 200 μL Tween te combineren. Bereid 10% Normal Horse Serum (NHS) door 1 ml NHS te combineren met 9 ml antilichaamverdunningsmiddel (stap 8.4.1). Bereid 1% NHS voor door 1 ml 10% NHS te combineren met 9 ml TBST. ImmunofluorescentiekleuringVerwijder de glaasjes vanaf -20 °C en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur. Was de dia’s drie keer in gedestilleerd water gedurende elk 5 minuten. Blokkeer de dia’s gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in 10% NHS in antilichaamverdunningsmiddel (stap 8.4.3). Verdun het primaire antilichaam (pan-cytokeratine) tot 1:750 in 1% NHS in TBST (stap 8.4.4). Incubeer glaasjes in het verdunde primaire antilichaam ‘s nachts bij 4 °C. Was de volgende dag de dia’s drie keer met een 1x wasbuffer (PBS of TBST) gedurende elk 5 minuten. Verdun het secundaire antilichaam tot 1:1.000 in 1% NHS in TBST (stap 8.4.4). Incubeer de glaasjes in het verdunde secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de dia’s drie keer met 1x wasbuffer gedurende 5 minuten elk. Monteer en bedek de dia’s met hardset montagemedia met DAPI. Gebruik een wattenstaafje om eventuele bubbels onder de deklaag voorzichtig uit te rollen.

Representative Results

Met behulp van deze methoden werden zeldzame populaties van epitheelcellen in het bloed en beenmerg van normale mensen en muizen gevisualiseerd. Met de juiste compensaties en controles zoals beschreven, waren de resultaten consistent die 4% -5% van de cellen in murine beenmerg lieten zien EpCAM +, ongeacht hoeveel cellen werden geteld, zoals weergegeven in figuur 4 en figuur 5. In muizenbloedmonsters was minder dan 0,5% van de cellen EpCAM+, zoals weergegeven in figuur 6. In menselijke beenmergmonsters was 2%-5% van de cellen EpCAM+, zoals weergegeven in figuur 7 en figuur 8. Hoewel 2% -5% een groot bereik is, waren de percentages binnen elke individuele donor consistent omdat er stapsgewijs meer cellen werden geteld. In menselijke bloedmonsters was ongeveer 0,3% van de cellen EpCAM+, zoals weergegeven in figuur 9. Onze controlemonsters (geen vlek, isotypecontrole en FMO’s) leverden zeer weinig fout-positieve EpCAM+ resultaten op, zoals weergegeven in figuur 4 en figuur 7. Cellen uit de EpCAM+ en EpCAM-groepen die op dia’s werden gesorteerd, vertoonden positieve kleuring voor pan-cytokeratine in EpCAM+-monsters en waren negatief voor pan-cytokeratine in EpCAM-monsters, zoals weergegeven in figuur 10. Deze resultaten geven aan dat de experimenten op de juiste manier waren ontworpen en reproduceerbaar. Figuur 1: Krt14Cre;mTmG transgene muizen met incrementele tellingen van beenmerg. Het beenmerg van Krt1-14;mTmG muizen werden stapsgewijs geteld. GFP-positieve cellen duiden op keratine 14-expressie en werden geïdentificeerd met behulp van flowcytometrie. Naarmate er meer beenmergcellen werden geteld, was deze keratine 14-positieve celpopulatie gemakkelijker identificeerbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Workflow voor EpCAM+ en cytokeratine+ cellen. Het beenmerg en de bloedcellen werden eerst gesorteerd met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om EpCAM+ en EpCAM-cellen te scheiden. Deze cellen werden gesorteerd in twee verschillende reageerbuizen en op twee verschillende dia’s. De cellen gesorteerd in reageerbuizen werden op dia’s gesponnen met behulp van een cytocentrifuge. De dia’s werden vervolgens gekleurd met behulp van een pan-cytokeratine primair antilichaam en vervolgens gekleurd met een secundair antilichaam. De dia’s werden geanalyseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie om pancytokeratine-expressie te observeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Software voor flowcytometrie-analyse. Bij het analyseren van flowcytometriegegevens met behulp van analysesoftware wordt de no stain-controle gebruikt om de cellen van belang te selecteren. Cellen worden eerst geselecteerd met SSC-A en FSC-A, die de interne complexiteit en grootte van de cellen laten zien. (A) Een veelhoekige poort wordt rond de cellen getekend. (B) Enkele cellen worden verkregen door gating SSC-A door SSC-W. (C) Levende cellen worden verkregen door fsc-A versus DAPI te gaten. (D) EpCAM-negatieve cellen worden uitgesloten door gating rechts van de EpCAM-negatieve cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Flowcytometrische analyse van EpCAM+ cellen in het beenmerg van de muis. Besturingselementen van geen vlek, isotype en FMO’s worden weergegeven in het bovenste paneel, met de incrementele tellingen van 50.000, 100.000 en 500.000 cellen weergegeven in het onderste paneel. Deze grafieken visualiseren de consistentie in percentages tussen tellingen, ondanks de algehele toename van het totale aantal getelde cellen. De panelen aan de rechterkant geven de gatingstrategie aan, zoals eerder besproken in de sectie flowcytometrieanalyse en zoals weergegeven in figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: EpCAM+-cellen in het beenmerg van muizen vormen 5,17% ± 0,001% van de bevolking. De beenmergcellen van drie individuele muizen werden geanalyseerd. De juiste controles werden opgenomen voor een goede wetenschappelijke nauwkeurigheid. Het percentage positieve cellen bleef consistent in de monsters, omdat de muizen genetisch identiek waren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: EpCAM+-cellen in muizenbloed vormen 0,45% ± 0,0006% van de bevolking. De bloedcellen van twee individuele muizen werden geanalyseerd. Er werden controles opgenomen om aan te tonen dat de juiste procedure werd gevolgd om sluitende resultaten te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Flowcytometrische analyse op EpCAM+ menselijk beenmerg. Besturingselementen van geen vlek, isotype en FMO’s worden weergegeven in het bovenste paneel en de incrementele tellingen van 50.000, 100.000 en 500.000 cellen worden weergegeven in het onderste paneel. Deze grafieken visualiseren de consistentie in percentages tussen tellingen, ondanks de algehele toename van het totale aantal getelde cellen. De panelen aan de rechterkant geven de gatingstrategie aan, zoals eerder besproken in de sectie flowcytometrieanalyse en zoals weergegeven in figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: EpCAM+-cellen in menselijk beenmerg vormen 3,53% ± 0,006% van de bevolking. Drie verschillende menselijke beenmergmonsters werden geanalyseerd. Er werden passende controles voor wetenschappelijke strengheid opgenomen. Het percentage positieve cellen varieert als gevolg van genetische heterogeniteit tussen mensen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 9: EpCAM+-cellen van menselijk bloed vormen 0,18% ± 0,0004% van de bevolking. Drie verschillende menselijke bloedmonsters werden geanalyseerd. Er werden passende controles voor wetenschappelijke strengheid opgenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 10: Immunofluorescentie van EpCAM+ en EpCAM-dia’s. FACS werd gebruikt om EpCAM+ en EpCAM-cellen te scheiden. Pan-cytokeratine werd gekleurd voor het gebruik van het DAKO pan-cytokeratine antilichaam. Er werd geen primaire antilichaamcontrole in normaal serum gebruikt, omdat het pancytokeratine een polyklonaal antilichaam is. Deze resultaten bevestigen de nauwkeurigheid van FACS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Menselijk beenmerg of bloed Antistof Buis # # van cellen AB Conc Onbevlekt 1 1×106 X Alleen DAPI 2 1×106 1uL/ml PE isotype controle 3 1×106 1 uL CD49f-PE Enkele vlekcontrole 4 1×106 20 uL in 100uL per 1×106 EpCAM-PE Lage Titratie 5 1×106 3 uL in 100uL per 1×106 EpCAM-PE Medium Titratie 6 1×106 4 uL in 100uL per 1×106 EpCAM-PE Hoge Titratie 7 1×106 5 uL in 100uL per 1×106 EpCAM-PE High Sort op dia’s 8 10×106 50 uL in 1 ml Tabel 1: Kleuringspaneel voor flowcytometrie. Een voorbeeld van een flowcytometriekleuringspaneel voor mononucleaire bloed- of beenmergcellen. Inbegrepen controles zijn alleen DAPI, niet-gekleurde controle en PE enkele vlekcontrole (PE-CD49f werd gebruikt als een betere positieve controle). Fluorescentie minus één is niet inbegrepen in dit paneel omdat het slechts een enkele kleur (PE) is. Bij het toevoegen van meer fluorofoorkleuren, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) of allophycocyanine (APC), moeten FMO’s worden opgenomen door één fluorofoor uit te sluiten voor elke FMO-controle. Aanvullend dossier 1: Live cell counting met behulp van hematocytometer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Er is enig bewijs in de literatuur van de aanwezigheid van epitheelcellen in het beenmerg. Eerder hebben artikelen meestal de rol van epitheelcellen onderzocht binnen de context van ziekte en letsel, zoals in de lever, longen, gastro-intestinale (GI) tractus, thymus en huid14,15,16,17. Er is echter niet veel bekend over de aanwezigheid van deze epitheelcellen in het beenmerg van gezonde personen. Dit artikel probeert een reproduceerbare methode vast te stellen, met als doel epitheelcellen te identificeren en te isoleren uit normaal bloed en beenmerg. Deze methode zal het veld vooruit helpen om te identificeren waarom epitheelcellen aanwezig zijn en wat hun rol is in het bloed en beenmerg in afwezigheid van ziekte; Misschien maken deze cellen deel uit van normaal weefselonderhoud of worden ze geactiveerd op momenten van letsel. Het beenmerg is een opslagplaats van stamcellen; Het is echter onduidelijk wat de afstamming van deze epitheelcellen kan zijn. Een recent artikel bespreekt van beenmerg afgeleide epitheelcellen in de thymus, die eerst EpCAM en de hematopoietische marker CD45 tot expressie brengen en vervolgens na verloop van tijd zijn CD45-expressie verliest na verwonding15. Onderzoek van ons laboratorium heeft ook de aanwezigheid van CD45 + EpCAM + -cellen in gezond bloed en beenmerg bevestigd in afwezigheid van letsel12. De rol van deze cellen moet echter nog worden bepaald.

Er was behoefte aan een reproduceerbare methode om epitheelcellen in het gezonde beenmerg te onderzoeken. De beschreven methode zal helpen bij het verder karakteriseren van deze cellen in hun normale toestand. Er zijn belangrijke stappen in deze methode om de reproduceerbaarheid te behouden. Een van de meest kritieke stappen in dit protocol is het handhaven van een steriele omgeving in de kap tijdens het oogsten van het beenmerg van muizen. Bij het oogsten van meerdere muizen wordt kruisbesmetting tussen monsters vermeden door voor elke muis nieuwe naalden en spuiten te gebruiken. Dit zorgt er ook voor dat het monster schoon is en vrij van verontreinigingen die de resultaten kunnen beïnvloeden. Bovendien moet het aantal voorbereide spuiten en gelabelde conische buizen voor elke extra muis worden verhoogd. Een andere belangrijke stap is het spoelen van de botten totdat een schone witte kleur duidelijk is om ervoor te zorgen dat de meeste beenmergcellen zijn verwijderd; De kans op het detecteren van zeldzame cellen neemt toe in een zuiverder monster. Er werd een wijziging aangebracht om het rode bloedcellyseprotocol te optimaliseren; Verschillende lysisbuffers werden getest om de juiste te vinden die consistent hoge levensvatbaarheid gaf, omdat bijna de helft van de cellen tijdens deze stap verloren ging. Verschillende reagentia en incubatietijden moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor verbeterde resultaten in andere instellingen.

De belangrijkste beperking van dit protocol is het gebruik van flowcytometrie voor het vinden van zeldzame celpopulaties. Zoals eerder besproken, helpt de toevoeging van controles en incrementele tellingen de specificiteit en nauwkeurigheid van de analyse te vergroten. Een andere beperking is dat geschikte markers voor de populatie van belang vooraf moeten worden geïdentificeerd. Men moet dus op de hoogte zijn van belangrijke markers, antilichamen voor flowcytometrie en antilichamen die compatibel zijn met de doelsoort.

Deze methoden zijn een verbetering ten opzichte van bestaande methoden omdat ze analyse van één cel mogelijk maken tegen een fractie van de kosten van de bestaande automatische CTC-isolator en single cell RNA-sequencing. Bovendien is flowcytometrie gemakkelijker beschikbaar. FACS handhaafde een hogere levensvatbaarheid voor de cellen in vergelijking met eerder gerapporteerde resultaten met behulp van magnetische microbeadscheiding. Ten slotte maken deze technieken de scheiding van cellen mogelijk voor downstream-analyses, zoals bulk RNA-sequencing, scRNA-sequencing of celkweek.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Josh Monts, Core Facility Flow Cytometer Technician, The Hormel Institute

Todd Schuster, Core Facility Manager, Het Hormel Instituut

Derek Gordon, statisticus, Rutgers University

We willen Karen Klein van Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM bedanken voor haar redactionele hulp.

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health onder awardnummer R21 AR075281, en een grant-in-aid of research, artistry and scholarship, Office of the Vice President for Research, University of Minnesota (Proposal #324240). We zijn dankbaar voor de steun van The Hormel Institute.

Materials

40 μm Cell Strainer Falcon 352340 Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow
5 mL Polystyrene Round-bottom tube Falcon 352054 Tubes used for flow cytometry
500 mL jar with lid Nalgene 11-823-32 Used to wash the mouse
190 proof Ethanol Decon laboratories Inc 2801 Diluted to 70% with dH2O
Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11008 Dilution: 1:1000
Brightline Hemacytometer Hausser Scientific 02-671-10 Used to count alive cells
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoResearch 001-000-162 Component of antibody diluent
Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30071.03 Component of staining buffer and harvesting solution
Curity gauze sponges Covidien 2187 Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow
Curved Forceps Miltex 18-784 Used during harvest
Cytokeratin, Wide Spectrum Screening Dako Z0622 Dilution 1:750 *Now discontinued
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) Gibco 14190-144 500mL Used to stop the red blood cell lysis reaction
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E9884-100G Used at 0.5 M 
Gentamicin sulfate Lonza 17-518Z Component of harvesting solution
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) Gibco 14175-095 500mL Component of harvesting solution and staining buffer solution
Luer-Lok tip 10 mL syringe Becton, Dickinson and Co 309604 Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps
Magic touch 2 ice bucket BelArt M16807-2001 Used to store the specimens on ice
Nonfat dry milk Apex 20-241 Component of Antibody Diluent
Normal horse serum Vector ZE0122 Component of Antibody Diluent
PE anti-human CD 326 (EpCAM) Biolegend 324206 Dilution: 5 µl in 100 µl per 1×106 cells
PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) Biolegend 118205 Dilution: 3 µl in 100 µl per 1×106 cells
PE mouse IgG2b, κ isotype control Biolegend 400313 Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells
PE rat anti-human CD49f BD Biosciences 555763 Dilution: 20 µl in 100 µl per 1×106 cells
PE rat IgG2am, κ Isotype control Biolegend 400508 Dilution: 1 µl in 100 µl per 1×106 cells
Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL Basix 14-955-240 Used in the centrifuge
Povidone-Iodine Scrub Aplicare 82-227 Antiseptic used to sterilize the mice
PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 Becton, Dickinson and Co 305176 20G needle used to break up bone marrow clumps
PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 Becton, Dickinson and Co 305111 26G needle used to flush bone marrow from bones
PTFE Printed Slides Electron Microscopy Services 63422-06 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence
RBC Lysis buffer 10X Invitrogen 00-4300-54 Dilution 1:10 using sterile deionized water
Scissors Roboz RS-6762 Used during harvest
Stainless steel surgical blade #4 Bard-Parker 371222 Used during harvest
Sterile tray Polar ware 10F Used during harvest
StretchEase Powder-free nitrile examination gloves Denville Scientific G4161 Used during harvest
Surgical Scalpel handle #4 Fischer 12-000-164 Used with surgical blade
TBS 20x Thermo Component of TBST, used at 1X
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 Used to count dead cells. Filtered with .45 µm
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-500mL Component of TBST
Tweezers Miltex 6-8 Used during harvest
Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI Vector H-1800 Nuclear stain for immunofluorescence
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, S. B., Cowley, C. J., Fuchs, E. Epithelial cells: liaisons of immunity. Current Opinion in Immunology. 62, 45-53 (2020).
  2. Blanpain, C., Fuchs, E. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
  3. Coradini, D., Casarsa, C., Oriana, S. Epithelial cell polarity and tumorigenesis: New perspectives for cancer detection and treatment. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (5), 552-564 (2011).
  4. Dmello, C., et al. Multifaceted role of keratins in epithelial cell differentiation and transformation. Journal of Biosciences. 44 (2), 33 (2019).
  5. Poulet, G., Massias, J., Taly, V. Liquid biopsy: General concepts. Acta Cytologica. 63 (6), 449-455 (2019).
  6. Eslami-S, Z., Cortés-Hernández, L. E., Alix-Panabières, C. Epithelial cell adhesion molecule: an anchor to isolate clinically relevant circulating tumor cells. Cells. 9 (8), 1836 (2020).
  7. Morris, R. J. Circulating tumor cells: quintessential precision oncology presenting challenges for biology. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 16 (2017).
  8. Lin, D., et al. Circulating tumor cells: biology and clinical significance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 404 (2021).
  9. Spence, M., Adai, S., Landon, T., Richter, G. Few and far between: Tools and strategies for rare-event detection using flow cytometry. BioprobesJournal of Cell Biology. 71, 14-18 (2015).
  10. Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. Journal of Cell Biology. 192 (3), 373-382 (2011).
  11. Ye, Q., Ling, S., Zheng, S., Xu, X. Liquid biopsy in hepatocellular carcinoma: circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Molecular Cancer. 18 (1), 114 (2019).
  12. Park, H., et al. marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
  13. Marsman, W. A., et al. Epithelial cells in bone marrow: do they matter. Gut. 54 (12), 1821-1822 (2005).
  14. Borue, X., et al. marrow-derived cells contribute to epithelial engraftment during wound healing. The American Journal of Pathology. 165 (5), 1767-1772 (2004).
  15. Chakrabarti, S., et al. marrow-derived cells contribute to the maintenance of thymic stroma including TECs. Journal of Immunology Research. 2022, 6061746 (2022).
  16. Krause, D. S., et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 105 (3), 369-377 (2001).
  17. Wong, A. P., et al. Targeted cell replacement with bone marrow cells for airway epithelial regeneration. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L740-L752 (2007).

Tags

EpCAMCytokeratinEpithelial CellsBloodBone MarrowFlow CytometryCirculating Tumor CellsDevelopmental BiologyStem Cell BiologyRegenerative TherapiesWound HealingMouseBone HarvestBone Marrow Extraction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Holtorf, S. M., Boyle, J., Morris, R. Evidence for EpCAM and Cytokeratin Expressing Epithelial Cells in Normal Human and Murine Blood and Bone Marrow. J. Vis. Exp. (194), e65118, doi:10.3791/65118 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image