Elucidando o metabolismo do 2,4-dibromofenol em plantas
Summary
O presente protocolo descreve um método simples e eficiente para a identificação de metabólitos do 2,4-dibromofenol em plantas.
Abstract
As culturas podem ser extensivamente expostas a poluentes orgânicos, uma vez que o solo é um importante sumidouro de poluentes descartados no meio ambiente. Isso cria exposição humana potencial através do consumo de alimentos acumulados por poluentes. A elucidação da absorção e metabolismo de xenobióticos em culturas é essencial para a avaliação do risco de exposição dietética em humanos. No entanto, para tais experimentos, o uso de plantas intactas requer experimentos de longo prazo e protocolos complexos de preparação de amostras que podem ser afetados por vários fatores. Culturas de calos vegetais combinadas com espectrometria de massas de alta resolução (HRMS) podem fornecer uma solução para a identificação precisa e econômica de metabólitos de xenobióticos em plantas, pois pode evitar a interferência do microambiente microbiano ou fúngico, encurtar a duração do tratamento e simplificar o efeito de matriz de plantas intactas. O 2,4-dibromofenol, um retardante de chama típico e desregulador endócrino, foi escolhido como substância modelo devido à sua ampla ocorrência no solo e ao seu potencial de absorção pelas plantas. Neste trabalho, calos vegetais foram gerados a partir de sementes de assepsia e expostos a meio de cultura estéril contendo 2,4-dibromofenol. Os resultados mostraram que oito metabólitos do 2,4-dibromofenol foram identificados nos tecidos do calo vegetal após 120 h de incubação. Isso indica que o 2,4-dibromofenol foi rapidamente metabolizado nos tecidos do calo vegetal. Assim, a plataforma de cultura de calos vegetais é um método eficaz para avaliar a absorção e o metabolismo de xenobióticos em plantas.
Introduction
Um número crescente de poluentes orgânicos tem sido descartado no meio ambiente devido às atividades antrópicas 1,2, sendo o solo considerado um importante sumidouro desses contaminantes 3,4. Os contaminantes presentes no solo podem ser absorvidos pelas plantas e potencialmente transferidos para organismos de nível trófico superior ao longo das cadeias alimentares, entrando diretamente no corpo humano por meio do consumo das culturas, levando consequentemente à exposição não intencional 5,6. As plantas utilizam diferentes vias para metabolizar xenobióticos para desintoxicação7; A elucidação do metabolismo dos xenobióticos é importante, pois controla o real destino dos contaminantes nas plantas. Como os metabólitos podem ser excretados pelas folhas (para a atmosfera) ou pelas raízes, a determinação dos metabólitos nas fases iniciais de exposição oferece a possibilidade de testar um número extenso de metabólitos8. No entanto, estudos utilizando plantas intactas requerem experimentos de longa duração e protocolos complexos de preparo de amostras que podem ser afetados por vários fatores.
As culturas de calos vegetais, portanto, são uma boa alternativa para estudar o metabolismo de xenobióticos em planta, pois podem encurtar muito o tempo de tratamento. Essas culturas excluem a interferência microbiana e a degradação fotoquímica, simplificam o efeito de matriz de plantas intactas, padronizam as condições de cultivo e requerem menor esforço experimental. Culturas de calos vegetais têm sido aplicadas com sucesso como uma abordagem alternativa em estudos metabólicos de triclosan9, nonilfenol10 e tebuconazol8. Esses estudos mostraram que os padrões metabólicos nas culturas de calos foram semelhantes aos das plantas intactas. Este trabalho propõe um método para a identificação eficiente e precisa de metabólitos de xenobióticos em plantas sem protocolos complexos e demorados. Neste trabalho, utilizamos culturas de calos vegetais em combinação com espectrometria de massas de alta resolução para a análise de metabólitos com sinais de baixa intensidade11,12.
Para tanto, suspensões de calos de cenoura (Daucus carota var. sativus) foram expostas a 100 μg/L de 2,4-dibromofenol por 120 h em agitador a 130 rpm e 26 °C. O 2,4-dibromofenol foi escolhido devido à sua atividade endócrina disruptiva13 e ampla ocorrência no solo14. Os metabólitos foram extraídos e analisados por espectrometria de massas de alta resolução. O protocolo aqui proposto pode investigar o metabolismo in planta de outros tipos de compostos orgânicos que podem ser ionizados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo foi desenvolvido para identificar eficientemente a biotransformação de xenobióticos em plantas. A etapa crítica deste protocolo é o cultivo do calo vegetal. A parte mais difícil é a diferenciação e manutenção do calo vegetal, pois o calo vegetal é facilmente infectado e desenvolvido para os tecidos vegetais. Portanto, é importante certificar-se de que todos os equipamentos utilizados sejam autoclavados e que todas as operações sejam realizadas em condições assépticas. A diferenciação e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (21976160) e pelo Projeto de Pesquisa de Aplicação de Tecnologia de Bem-Estar Público da Província de Zhejiang (LGF21B070006).
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
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