הבהרת חילוף החומרים של 2,4-דיברומופנול בצמחים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה לזיהוי מטבוליטים של 2,4-דיברומופנול בצמחים.
Abstract
גידולים חקלאיים עלולים להיחשף באופן נרחב למזהמים אורגניים, שכן הקרקע מהווה שקע מרכזי למזהמים המושלכים לסביבה. כך נוצרת חשיפה פוטנציאלית של בני אדם באמצעות צריכת מזונות שהצטברו במזהמים. הבהרת הספיגה והמטבוליזם של קסנוביוטיקה בגידולים חיונית להערכת הסיכון לחשיפה תזונתית בבני אדם. עם זאת, עבור ניסויים כאלה, השימוש בצמחים שלמים דורש ניסויים ארוכי טווח ופרוטוקולים מורכבים להכנת דגימות שיכולים להיות מושפעים מגורמים שונים. תרביות יבלות צמחיות בשילוב עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה (HRMS) עשויות לספק פתרון לזיהוי מדויק וחוסך זמן של מטבוליטים של קסנוביוטיקה בצמחים, שכן הן יכולות למנוע הפרעה מהמיקרו-סביבה המיקרוביאלית או הפטרייתית, לקצר את משך הטיפול ולפשט את אפקט המטריצה של צמחים שלמים. 2,4-dibromophenol, מעכב בעירה טיפוסי ומשבש אנדוקריני, נבחר כחומר המודל בשל הופעתו הנפוצה בקרקע ופוטנציאל ספיגתו על ידי צמחים. כאן, יבלת צמחית הופקה מזרעי אספסיס ונחשף למדיום תרבית סטרילי המכיל 2,4-דיברומופנול. התוצאות הראו כי שמונה מטבוליטים של 2,4-dibromophenol זוהו ברקמות יבלת הצמח לאחר 120 שעות של דגירה. זה מצביע על כך 2,4-dibromophenol היה מטבוליזם במהירות ברקמות יבלת הצמח. לפיכך, פלטפורמת תרבית יבלת הצמחים היא שיטה יעילה להערכת ספיגה ומטבוליזם של קסנוביוטיקה בצמחים.
Introduction
מספר גדל והולך של מזהמים אורגניים הושלכו לסביבה עקב פעילות אנתרופוגנית1,2, והקרקע נחשבת לכיור עיקרי עבור מזהמים אלה 3,4. המזהמים בקרקע יכולים להיקלט על ידי צמחים ולהיות מועברים פוטנציאלית לאורגניזמים ברמה טרופית גבוהה יותר לאורך שרשראות מזון, על ידי כניסה ישירה לגוף האדם באמצעות צריכת יבולים, וכתוצאה מכך להוביל לחשיפה לא מכוונת 5,6. צמחים משתמשים במסלולים שונים כדי לעכל קסנוביוטיקה לניקוי רעלים7; הבהרת חילוף החומרים של קסנוביוטיקה חשובה, שכן היא שולטת בגורלם האמיתי של מזהמים בצמחים. מכיוון שהמטבוליטים יכולים להיות מופרשים על ידי עלים (לאטמוספירה) או שורשים, קביעת המטבוליטים בשלבים המוקדמים מאוד של החשיפה ולכן מספקת את האפשרות לבדוק מספר רב של מטבוליטים8. עם זאת, מחקרים המשתמשים בצמחים שלמים דורשים ניסויים ארוכי טווח ופרוטוקולי הכנת דגימות מורכבים שיכולים להיות מושפעים מגורמים שונים.
תרביות יבלות צמחיות, אם כן, הן חלופה טובה לחקר חילוף החומרים של קסנוביוטיקה בצמח, שכן הן יכולות לקצר מאוד את זמן הטיפול. תרביות אלה שוללות הפרעות מיקרוביאליות ופירוק פוטוכימי, מפשטות את אפקט המטריצה של צמחים שלמים, מתקננות את תנאי הגידול ודורשות פחות מאמץ ניסיוני. תרביות יבלות צמחיות יושמו בהצלחה כגישה חלופית במחקרים מטבוליים של טריקלוזן9, נונילפנול10 וטבוקונזול8. מחקרים אלה הראו כי הדפוסים המטבוליים בתרביות יבלות היו דומים לאלה שבצמחים שלמים. מחקר זה מציע שיטה לזיהוי יעיל ומדויק של מטבוליטים של קסנוביוטיקה בצמחים ללא פרוטוקולים מורכבים וגוזלי זמן. כאן, אנו משתמשים בתרביות יבלות צמחיות בשילוב עם ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה לניתוח מטבוליטים עם אותות בעוצמה נמוכה11,12.
לשם כך, תרחיפים של יבלת גזר (Daucus carota var. sativus) נחשפו ל-100 מיקרוגרם/ליטר של 2,4-דיברומופנול במשך 120 שעות בשייקר ב-130 סל”ד וב-26 מעלות צלזיוס. 2,4-דיברומופנול נבחר בשל פעילותו האנדוקרינית המשבשת13 והופעתו הנרחבת בקרקע14. המטבוליטים חולצו ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול המוצע כאן יכול לחקור את חילוף החומרים בצמח של סוגים אחרים של תרכובות אורגניות שניתן ליונן.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה פותח כדי לזהות ביעילות את הביוטרנספורמציה של קסנוביוטיקה בצמחים. השלב הקריטי של פרוטוקול זה הוא התרבות של יבלת הצמח. החלק הקשה ביותר הוא התמיינות ותחזוקה של יבלת הצמח, מכיוון שהיבלת הצמחית נגועה בקלות ומתפתחת לרקמות הצמח. לכן, חשוב לוודא כי כל הציוד המשמש הוא autoclaved, וכל הפעולות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21976160) ופרויקט מחקר יישומי טכנולוגיית רווחה ציבורית במחוז ג’ג’יאנג (LGF21B070006).
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
References
- Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
- Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
- Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
- Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
- Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
- Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
- Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
- Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
- Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
- Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
- Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
- Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
- Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
- de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
- Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
- Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
- Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
- Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).
