Opheldering van het metabolisme van 2,4-dibroomfenol in planten
Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor de identificatie van 2,4-dibroomfenolmetabolieten in planten.
Abstract
Gewassen kunnen op grote schaal worden blootgesteld aan organische verontreinigende stoffen, omdat de bodem een belangrijke put is voor verontreinigende stoffen die in het milieu worden weggegooid. Dit creëert potentiële blootstelling van de mens door de consumptie van verontreinigende voedingsmiddelen. Het ophelderen van de opname en het metabolisme van xenobiotica in gewassen is essentieel voor de beoordeling van het blootstellingsrisico via de voeding bij de mens. Voor dergelijke experimenten vereist het gebruik van intacte planten echter langetermijnexperimenten en complexe monstervoorbereidingsprotocollen die door verschillende factoren kunnen worden beïnvloed. Planteneeltculturen in combinatie met hoge-resolutie massaspectrometrie (HRMS) kunnen een oplossing bieden voor de nauwkeurige en tijdbesparende identificatie van metabolieten van xenobiotica in planten, omdat het interferentie van de microbiële of schimmelmicro-omgeving kan voorkomen, de behandelingsduur kan verkorten en het matrixeffect van intacte planten kan vereenvoudigen. 2,4-dibroomfenol, een typische vlamvertrager en hormoonontregelaar, werd als modelstof gekozen vanwege het wijdverbreide voorkomen ervan in de bodem en het opnamepotentieel ervan door planten. Hierin werd planteelt gegenereerd uit asepsiszaden en blootgesteld aan steriel 2,4-dibroomfenolbevattend cultuurmedium. De resultaten toonden aan dat acht metabolieten van 2,4-dibroomfenol werden geïdentificeerd in de eeltweefsels van de plant na 120 uur incubatie. Dit geeft aan dat 2,4-dibroomfenol snel werd gemetaboliseerd in de eeltweefsels van de plant. Het platform voor planteneelkweek is dus een effectieve methode om de opname en het metabolisme van xenobiotica in planten te evalueren.
Introduction
Een toenemend aantal organische verontreinigende stoffen is in het milieu gegooid als gevolg van antropogene activiteiten1,2, en de bodem wordt beschouwd als een belangrijke put voor deze verontreinigingen 3,4. De verontreinigingen in de bodem kunnen door planten worden opgenomen en mogelijk worden overgedragen op organismen op een hoger trofisch niveau langs voedselketens, door rechtstreeks het menselijk lichaam binnen te dringen via gewasconsumptie, wat leidt tot onbedoelde blootstelling 5,6. Planten gebruiken verschillende routes om xenobiotica te metaboliseren voor ontgifting7; Het ophelderen van het metabolisme van xenobiotica is belangrijk, omdat het het feitelijke lot van verontreinigingen in planten beheerst. Aangezien de metabolieten door bladeren (naar de atmosfeer) of de wortels kunnen worden uitgescheiden, biedt het bepalen van de metabolieten in de zeer vroege stadia van blootstelling dus de mogelijkheid om een uitgebreid aantal metabolieten te testen8. Studies met intacte planten vereisen echter langetermijnexperimenten en complexe monstervoorbereidingsprotocollen die door verschillende factoren kunnen worden beïnvloed.
Plantaardige eeltculturen zijn daarom een goed alternatief voor het bestuderen van het metabolisme van xenobiotica in planta, omdat ze de behandelingstijd aanzienlijk kunnen verkorten. Deze culturen sluiten microbiële interferentie en fotochemische afbraak uit, vereenvoudigen het matrixeffect van intacte planten, standaardiseren de teeltomstandigheden en vereisen minder experimentele inspanning. Plantaardige eeltculturen zijn met succes toegepast als een alternatieve benadering in metabole studies van triclosan9, nonylfenol10 en tebuconazol8. Deze studies toonden aan dat de metabole patronen in eeltculturen vergelijkbaar waren met die in intacte planten. Deze studie stelt een methode voor voor de efficiënte en nauwkeurige identificatie van metabolieten van xenobiotica in planten zonder complexe en tijdrovende protocollen. Hier gebruiken we plantaardige eeltculturen in combinatie met hoge resolutie massaspectrometrie voor de analyse van metabolieten met lage intensiteit signalen11,12.
Hiertoe werden wortel (Daucus carota var. sativus) eeltsuspensies gedurende 120 uur blootgesteld aan 100 μg/l 2,4-dibroomfenol in een schudder bij 130 tpm en 26 °C. 2,4-dibroomfenol werd gekozen vanwege de verstorende endocriene activiteit13 en het wijdverbreide voorkomen in bodem14. De metabolieten werden geëxtraheerd en geanalyseerd met behulp van hoge resolutie massaspectrometrie. Het hier voorgestelde protocol kan het in planta-metabolisme onderzoeken van andere soorten organische verbindingen die kunnen worden geïoniseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is ontwikkeld om de biotransformatie van xenobiotica in planten efficiënt te identificeren. De cruciale stap van dit protocol is de cultuur van het planteel. Het moeilijkste deel is de differentiatie en het onderhoud van het planteneel, omdat het planteneelt gemakkelijk wordt geïnfecteerd en ontwikkeld tot plantenweefsels. Daarom is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle gebruikte apparatuur wordt geautoclaveerd en dat alle bewerkingen onder aseptische omstandigheden worden uitgevoerd. De differentiat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (21976160) en het Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006).
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
References
- Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
- Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
- Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
- Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
- Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
- Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
- Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
- Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
- Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
- Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
- Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
- Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
- Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
- de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
- Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
- Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
- Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
- Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).
