Chiarire il metabolismo del 2,4-dibromofenolo nelle piante
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo semplice ed efficace per l’identificazione dei metaboliti del 2,4-dibromofenolo nelle piante.
Abstract
Le colture possono essere ampiamente esposte a inquinanti organici, poiché il suolo è un importante pozzo di assorbimento per gli inquinanti scartati nell’ambiente. Ciò crea una potenziale esposizione umana attraverso il consumo di alimenti inquinanti accumulati. Chiarire l’assorbimento e il metabolismo degli xenobiotici nelle colture è essenziale per la valutazione del rischio di esposizione alimentare nell’uomo. Tuttavia, per tali esperimenti, l’uso di piante intatte richiede esperimenti a lungo termine e complessi protocolli di preparazione dei campioni che possono essere influenzati da vari fattori. Le colture di callo delle piante combinate con la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) possono fornire una soluzione per l’identificazione accurata e rapida dei metaboliti degli xenobiotici nelle piante, in quanto possono evitare interferenze dal microambiente microbico o fungino, ridurre la durata del trattamento e semplificare l’effetto matrice delle piante intatte. Il 2,4-dibromofenolo, un tipico ritardante di fiamma e interferente endocrino, è stato scelto come sostanza modello a causa della sua presenza diffusa nel suolo e del suo potenziale di assorbimento da parte delle piante. In questo caso, il callo della pianta è stato generato da semi di asepsi ed esposto a terreno di coltura sterile contenente 2,4-dibromofenolo. I risultati hanno mostrato che otto metaboliti del 2,4-dibromofenolo sono stati identificati nei tessuti del callo della pianta dopo 120 ore di incubazione. Ciò indica che il 2,4-dibromofenolo è stato rapidamente metabolizzato nei tessuti callosi della pianta. Pertanto, la piattaforma di coltura del callo vegetale è un metodo efficace per valutare l’assorbimento e il metabolismo degli xenobiotici nelle piante.
Introduction
Un numero crescente di inquinanti organici è stato scartato nell’ambiente a causa delle attività antropiche1,2 e il suolo è considerato un importante pozzo di assorbimento per questi contaminanti 3,4. I contaminanti presenti nel suolo possono essere assorbiti dalle piante e potenzialmente trasferiti a organismi di livello trofico superiore lungo le catene alimentari, entrando direttamente nel corpo umano attraverso il consumo delle colture, portando di conseguenza a un’esposizione involontaria 5,6. Le piante utilizzano diversi percorsi per metabolizzare gli xenobiotici per la disintossicazione7; Chiarire il metabolismo degli xenobiotici è importante, in quanto controlla il destino effettivo dei contaminanti nelle piante. Poiché i metaboliti possono essere escreti dalle foglie (nell’atmosfera) o dalle radici, la determinazione dei metaboliti nelle primissime fasi di esposizione offre quindi la possibilità di testare un numero esteso di metaboliti8. Tuttavia, gli studi che utilizzano piante intatte richiedono esperimenti a lungo termine e complessi protocolli di preparazione dei campioni che possono essere influenzati da vari fattori.
Le colture di callo delle piante, quindi, sono una buona alternativa per studiare il metabolismo degli xenobiotici nelle piante, in quanto possono ridurre notevolmente i tempi di trattamento. Queste colture escludono l’interferenza microbica e la degradazione fotochimica, semplificano l’effetto matrice delle piante intatte, standardizzano le condizioni di coltivazione e richiedono meno sforzo sperimentale. Le colture di callo vegetale sono state applicate con successo come approccio alternativo negli studi metabolici di triclosan9, nonilfenolo10 e tebuconazolo8. Questi studi hanno dimostrato che i modelli metabolici nelle colture di calli erano simili a quelli delle piante intatte. Questo studio propone un metodo per l’identificazione efficiente e accurata dei metaboliti degli xenobiotici nelle piante senza protocolli complessi e dispendiosi in termini di tempo. Qui, utilizziamo colture di calli vegetali in combinazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione per l’analisi di metaboliti con segnali a bassa intensità11,12.
A tal fine, le sospensioni di callo di carota (Daucus carota var. sativus) sono state esposte a 100 μg/L di 2,4-dibromofenolo per 120 ore in uno shaker a 130 giri/min e 26 °C. Il 2,4-dibromofenolo è stato scelto a causa della sua attività endocrina dirompente13 e della sua presenza diffusa nel suolo14. I metaboliti sono stati estratti e analizzati mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione. Il protocollo qui proposto può indagare il metabolismo in pianta di altri tipi di composti organici che possono essere ionizzati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è stato sviluppato per identificare in modo efficiente la biotrasformazione degli xenobiotici nelle piante. La fase critica di questo protocollo è la coltura del callo della pianta. La parte più difficile è la differenziazione e il mantenimento del callo della pianta, perché il callo della pianta si infetta facilmente e si sviluppa nei tessuti vegetali. Pertanto, è importante assicurarsi che tutte le apparecchiature utilizzate siano sterilizzate in autoclave e che tutte le operazioni vengano esegu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (21976160) e dal Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006) della provincia di Zhejiang.
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
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