Выяснение метаболизма 2,4-дибромфенола в растениях
Summary
В настоящем протоколе описан простой и эффективный метод идентификации метаболитов 2,4-дибромфенола в растениях.
Abstract
Сельскохозяйственные культуры могут подвергаться интенсивному воздействию органических загрязнителей, поскольку почва является основным поглотителем загрязняющих веществ, выбрасываемых в окружающую среду. Это создает потенциальное воздействие на человека при употреблении в пищу пищевых продуктов, накопленных загрязняющими веществами. Выяснение поглощения и метаболизма ксенобиотиков в сельскохозяйственных культурах имеет важное значение для оценки риска пищевого воздействия на людей. Однако для таких экспериментов использование интактных растений требует длительных экспериментов и сложных протоколов пробоподготовки, на которые могут влиять различные факторы. Каллусные культуры растений в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (HRMS) могут обеспечить решение для точной и экономящей время идентификации метаболитов ксенобиотиков в растениях, поскольку это позволяет избежать вмешательства со стороны микробного или грибкового микроокружения, сократить продолжительность обработки и упростить матричный эффект интактных растений. 2,4-дибромфенол, типичный антипирен и эндокринный разрушитель, был выбран в качестве модельного вещества из-за его широкого распространения в почве и его способности к поглощению растениями. При этом каллус растения был получен из семян асептики и подвергнут воздействию стерильной питательной среды, содержащей 2,4-дибромфенол. Результаты показали, что после 120 ч инкубации в каллусных тканях растений было идентифицировано восемь метаболитов 2,4-дибромфенола. Это свидетельствует о том, что 2,4-дибромфенол быстро метаболизировался в каллусных тканях растений. Таким образом, платформа каллусных культур растений является эффективным методом оценки поглощения и метаболизма ксенобиотиков в растениях.
Introduction
Все большее число органических загрязнителей выбрасывается в окружающую среду из-за антропогенной деятельности1,2, и почва считается основным поглотителем этих загрязнителей 3,4. Загрязняющие вещества в почве могут поглощаться растениями и потенциально передаваться организмам более высокого трофического уровня по пищевым цепям, непосредственно попадая в организм человека при употреблении в пищу сельскохозяйственных культур, что приводит к непреднамеренному воздействию 5,6. Растения используют различные пути метаболизма ксенобиотиков для детоксикации7; Выяснение метаболизма ксенобиотиков имеет важное значение, поскольку оно контролирует фактическую судьбу загрязняющих веществ в растениях. Поскольку метаболиты могут выводиться листьями (в атмосферу) или корнями, определение метаболитов на самых ранних стадиях воздействия, следовательно, дает возможность протестировать большее количество метаболитов8. Однако исследования с использованием интактных растений требуют длительных экспериментов и сложных протоколов пробоподготовки, на которые могут влиять различные факторы.
Таким образом, каллусные культуры растений являются хорошей альтернативой для изучения метаболизма ксенобиотиков в плантах, так как они могут значительно сократить время лечения. Эти культуры исключают микробную интерференцию и фотохимическую деградацию, упрощают матричный эффект интактных растений, стандартизируют условия культивирования и требуют меньших экспериментальных усилий. Каллусные культуры растений успешно применяются в качестве альтернативного подхода в метаболических исследованиях триклозана9, нонилфенола10 и тебуконазола8. Эти исследования показали, что метаболические паттерны в каллусных культурах были аналогичны таковым у интактных растений. В данном исследовании предложен метод эффективной и точной идентификации метаболитов ксенобиотиков в растениях без сложных и трудоемких протоколов. Здесь мы используем каллусные культуры растений в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения для анализа метаболитов с низкоинтенсивными сигналами11,12.
С этой целью каллусные суспензии моркови (Daucus carota var. sativus) подвергали воздействию 100 мкг/л 2,4-дибромфенола в течение 120 ч в шейкере при 130 об/мин и 26 °C. 2,4-дибромфенол был выбран из-за его разрушительной эндокринной активности13 и широкого распространения в почве14. Метаболиты были выделены и проанализированы методом масс-спектрометрии высокого разрешения. Предложенный здесь протокол позволяет исследовать метаболизм in planta других типов органических соединений, которые могут быть ионизированы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данный протокол был разработан для эффективной идентификации биотрансформации ксенобиотиков в растениях. Критическим этапом этого протокола является культивирование каллуса растения. Самой сложной частью является дифференциация и поддержание каллуса растения, потому что каллус ра…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (21976160) и Исследовательским проектом по применению технологий общественного благосостояния провинции Чжэцзян (LGF21B070006).
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
References
- Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
- Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
- Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
- Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
- Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
- Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
- Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
- Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
- Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
- Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
- Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
- Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
- Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
- de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
- Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
- Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
- Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
- Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).
