BS3 Ensayo de reticulación química: evaluación del efecto del estrés crónico en la superficie celular_{Presentación del} receptor GABA A en el cerebro de roedores

Los receptores de neurotransmisores se localizan en la superficie de la membrana plasmática neuronal o intracelularmente en las endomembranas (por ejemplo, el endosoma, el retículo endoplásmico [RE] o el aparato trans-Golgi) y se desplazan dinámicamente entre estos dos compartimentos dependiendo de los estados fisiológicos intrínsecos en las neuronas o en respuesta a las actividades de la red neuronal extrínseca ^1,2. Dado que los neurotransmisores recién secretados provocan sus funciones fisiológicas principalmente a través del conjunto de receptores localizados en la superficie, los niveles de receptores de superficie para un neurotransmisor dado son uno de los determinantes críticos de su capacidad de señalización dentro del circuito neuronal³.

Existen varios métodos disponibles para monitorizar los niveles de receptores de superficie en neuronas cultivadas, incluyendo el ensayo de biotinilación superficial⁴, el ensayo de inmunofluorescencia con un anticuerpo específico en condiciones no permeabilizadas⁵, o el uso de un transgén receptor genéticamente fusionado con un indicador óptico fluorescente sensible al pH (por ejemplo, pHluorin)⁶. Por el contrario, estos enfoques son limitados o poco prácticos cuando se evalúan los niveles de receptores de superficie in vivo. Por ejemplo, el procedimiento de biotinilación de superficie puede no ser práctico para procesar grandes cantidades y números de muestras de tejidos cerebrales in vivo debido a su precio relativamente alto y los pasos posteriores necesarios para purificar las proteínas biotiniladas en perlas conjugadas con avidina. Para las neuronas integradas en la arquitectura cerebral tridimensional, la baja accesibilidad de anticuerpos o las dificultades en la cuantificación basada en microscopios pueden plantear una limitación significativa para evaluar los niveles de receptores de superficie in vivo. Para visualizar la distribución de los receptores de neurotransmisores en cerebros intactos, se podrían utilizar métodos no invasivos, como la tomografía por emisión de positrones, para medir la ocupación del receptor y estimar los niveles de receptores de superficie⁷. Sin embargo, este enfoque se basa críticamente en la disponibilidad de ligandos de radio específicos, equipos costosos y experiencia especial, lo que lo hace menos accesible para el uso rutinario de la mayoría de los investigadores.

Aquí, describimos un método simple y versátil para medir los niveles de receptores de superficie en cerebros de animales experimentales ex vivo utilizando un reticulante químico soluble en agua e impermeable a la membrana, bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)^8,9. BS3 se dirige a aminas primarias en la cadena lateral de residuos de lisina y puede reticular covalentemente proteínas muy cercanas entre sí. Cuando los cortes de cerebro se preparan recién a partir de una región de interés y se incuban en un tampón que contiene BS3, los receptores de la superficie celular se entrecruzan con proteínas vecinas y, por lo tanto, se transforman en especies de mayor peso molecular, mientras que los receptores asociados a la endomembrana intracelular permanecen sin modificar. Por lo tanto, los grupos de receptores superficiales e intracelulares pueden separarse mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y cuantificarse mediante Western blot utilizando anticuerpos específicos para el receptor a estudiar.

El estrés crónico leve impredecible (EMU) es un paradigma experimental bien establecido para inducir estrés psicosocial crónico en roedores¹⁰. UCMS provoca fenotipos conductuales similares a la ansiedad / depresivos y déficits cognitivos a través de la modulación de una serie de sistemas de neurotransmisores, incluyendo GABA y sus receptores^10,11. En particular, el receptor GABA A que contiene la subunidad α5 (α5-GABA_A R) está implicado en la regulación de la memoria y las funciones cognitivas^12,13, lo que sugiere la posible participación de funciones alteradas de esta subunidad en los déficits cognitivos inducidos por UCMS. En este protocolo, utilizamos el ensayo de reticulación BS3 para cuantificar los niveles de α5-GABA_AR expresado en la superficie en la corteza prefrontal de ratones expuestos a UCMS en comparación con ratones de control no estresados.