BS3化学架橋アッセイ:げっ歯類の脳における細胞表面_GABAA 受容体提示に対する慢性ストレスの影響の評価

神経伝達物質受容体は、神経細胞の原形質膜表面または細胞内の内膜(エンドソーム、小胞体[ER]、トランスゴルジ体など)に局在し、ニューロンの内因性生理学的状態に応じて、または外因性ニューラルネットワーク活動に応答して、これら2つのコンパートメント間を動的に往復します^1,2.新たに分泌された神経伝達物質は、主に表面局在化した受容体のプールを介して生理学的機能を誘発するので、所与の神経伝達物質の表面受容体レベルは、神経回路内のそのシグナル伝達能力の重要な決定要因の1つである³。

培養ニューロンの表面受容体レベルをモニタリングするには、表面ビオチン化アッセイ⁴、非透過処理条件下での特異的抗体を用いた免疫蛍光アッセイ⁵、pH感受性蛍光光学指示薬(pHluorinなど)6と遺伝的に融合した受容体導入遺伝子^{の使用など、}いくつかの方法があります。対照的に、これらのアプローチは、 インビボで表面受容体レベルを評価する場合、限定的であるか実用的ではありません。例えば、表面ビオチン化手順は、その比較的高い価格およびアビジン結合ビーズ上のビオチン化タンパク質を精製するために必要な後続のステップのために、in vivo 脳組織の大量およびサンプル数の処理には実用的ではないかもしれない。3次元脳構造に埋め込まれたニューロンの場合、抗体のアクセシビリティが低いか、顕微鏡ベースの定量が難しいため、 in vivoでの表面受容体レベルを評価する上で大きな制限が生じる可能性があります。無傷の脳における神経伝達物質受容体の分布を視覚化するために、陽電子放出断層撮影法などの非侵襲的方法を使用して、受容体占有率を測定し、表面受容体レベル^を推定することができます7。ただし、このアプローチは、特定の放射性リガンド、高価な機器、および特別な専門知識の可用性に大きく依存しているため、ほとんどの研究者が日常的に使用することは困難になっています。

ここでは、水溶性で膜を透過しない化学架橋剤であるビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3^)8,9を使用して、実験動物の脳の表面受容体レベルをex vivoで測定するための簡単で汎用性の高い方法について説明します。BS3はリジン残基の側鎖にある第一級アミンを標的とし、互いに近接したタンパク質を共有結合的に架橋することができます。脳スライスを関心のある領域から新たに調製し、BS3を含むバッファー中でインキュベートすると、細胞表面受容体は隣接するタンパク質と架橋され、したがって、より高分子量の種に変換されますが、細胞内膜内関連受容体は修飾されません。したがって、表面受容体プールと細胞内受容体プールは、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、研究対象の受容体に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって定量することができます。

予測不可能な慢性軽度ストレス(UCMS)は、げっ歯類に慢性心理社会的ストレスを誘発するための確立された実験パラダイムです¹⁰。UCMSは、GABAとその受容体を含む一連の神経伝達物質系の調節を介して、不安/抑うつのような行動表現型と認知障害を誘発します^10,11。特に、α5サブユニット含有_{GABAA受容体}(α5-GABA_AR)は、記憶および認知機能の調節に関与しており^12,13、^UCMS誘発性認知障害におけるこのサブユニットの機能の変化の関与の可能性を示唆している。このプロトコルでは、BS3架橋アッセイを使用して、UCMSに曝露されたマウスの前頭前野における表面発現α5-GABA_ARのレベルを、非ストレス対照マウスと比較して定量しました。