BS3 Chemical Crosslinking Assay: Évaluation de l’effet du stress chronique sur la surface cellulaire Présentation du récepteur GABA_A dans le cerveau des rongeurs

Les récepteurs des neurotransmetteurs sont localisés soit à la surface de la membrane plasmique neuronale, soit intracellulaire sur les endomembranes (p. ex. l’endosome, le réticulum endoplasmique [ER] ou l’appareil trans-Golgi) et font la navette dynamique entre ces deux compartiments en fonction des états physiologiques intrinsèques des neurones ou en réponse aux activités extrinsèques du réseau neuronal ^1,2. Étant donné que les neurotransmetteurs nouvellement sécrétés suscitent leurs fonctions physiologiques principalement par le biais du pool localisé de récepteurs localisés en surface, les niveaux de récepteurs de surface pour un neurotransmetteur donné sont l’un des déterminants critiques de sa capacité de signalisation dans le circuit neuronal³.

Plusieurs méthodes sont disponibles pour surveiller les niveaux de récepteurs de surface dans les neurones en culture, y compris le test de biotinylation^{de surface 4}, le test d’immunofluorescence avec un anticorps spécifique dans des conditions non perméabilisées⁵, ou l’utilisation d’un transgène récepteur génétiquement fusionné avec un indicateur optique fluorescent sensible au pH (par exemple, pHluorin)⁶. En revanche, ces approches sont limitées ou peu pratiques lors de l’évaluation des niveaux de récepteurs de surface in vivo. Par exemple, la procédure de biotinylation de surface peut ne pas être pratique pour traiter de grandes quantités et un grand nombre d’échantillons de tissus cérébraux in vivo en raison de son prix relativement élevé et des étapes ultérieures nécessaires pour purifier les protéines biotinylées sur des billes conjuguées à l’avidine. Pour les neurones intégrés dans une architecture cérébrale tridimensionnelle, la faible accessibilité des anticorps ou les difficultés de quantification au microscope peuvent constituer une limitation importante pour l’évaluation des niveaux de récepteurs de surface in vivo. Pour visualiser la distribution des récepteurs des neurotransmetteurs dans les cerveaux intacts, des méthodes non invasives, telles que la tomographie par émission de positrons, pourraient être utilisées pour mesurer l’occupation des récepteurs et estimer les niveaux de récepteurs^{de surface 7}. Cependant, cette approche repose essentiellement sur la disponibilité de ligands radio spécifiques, d’équipements coûteux et d’une expertise spéciale, ce qui la rend moins accessible pour une utilisation régulière par la plupart des chercheurs.

Ici, nous décrivons une méthode simple et polyvalente pour mesurer les niveaux de récepteurs de surface dans des cerveaux d’animaux expérimentaux ex vivo à l’aide d’un agent de réticulation chimique soluble dans l’eau et imperméable à la membrane, le bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)^8,9. BS3 cible les amines primaires dans la chaîne latérale des résidus de lysine et peut réticuler de manière covalente les protéines à proximité les unes des autres. Lorsque les tranches de cerveau sont fraîchement préparées à partir d’une région d’intérêt et incubées dans un tampon contenant BS3, les récepteurs de surface cellulaire sont réticulés avec des protéines voisines et, par conséquent, se transforment en espèces de poids moléculaire plus élevé, tandis que les récepteurs associés à l’endomembrane intracellulaire restent inchangés. Par conséquent, les pools de récepteurs de surface et intracellulaires peuvent être séparés par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) et quantifiés par transfert Western à l’aide d’anticorps spécifiques au récepteur à étudier.

Le stress chronique léger imprévisible (UCMS) est un paradigme expérimental bien établi pour induire un stress psychosocial chronique chez les rongeurs¹⁰. UCMS provoque des phénotypes comportementaux anxieux / dépressifs et des déficits cognitifs via la modulation d’un éventail de systèmes de neurotransmetteurs, y compris le GABA et ses récepteurs^10,11. En particulier, le récepteur GABA A contenant la sous-unité α5 (α5-GABA_AR) est impliqué dans la régulation de la mémoire et des fonctions cognitives^12,13, suggérant l’implication possible de fonctions altérées de cette sous-unité dans les déficits cognitifs induits par UCMS. Dans ce protocole, nous avons utilisé le test de réticulation BS3 pour quantifier les niveaux d’α5-GABA_AR exprimé en surface dans le cortex préfrontal des souris exposées à l’UCMS par rapport aux souris témoins non stressées.