BS3 Chemical Crosslinking Assay: Avaliando o Efeito do Estresse Crônico na Apresentação do Receptor GABA_A na Superfície Celular no Cérebro de Roedores

Os receptores de neurotransmissores estão localizados na superfície da membrana plasmática neuronal ou intracelularmente nas endomembranas (por exemplo, o endossomo, o retículo endoplasmático [RE] ou o aparelho trans-Golgi) e transitam dinamicamente entre esses dois compartimentos, dependendo de estados fisiológicos intrínsecos nos neurônios ou em resposta a atividades de redes neurais extrínsecas ^1,2. Uma vez que os neurotransmissores recém-secretados provocam suas funções fisiológicas principalmente através do pool de receptores localizados na superfície, os níveis de receptores de superfície para um determinado neurotransmissor são um dos determinantes críticos de sua capacidade de sinalização dentro do circuito neural³.

Vários métodos estão disponíveis para monitorar os níveis de receptores de superfície em neurônios cultivados, incluindo o ensaio de biotinilação de superfície⁴, o ensaio de imunofluorescência com um anticorpo específico em condições não permeabilizadas⁵ ou o uso de um transgene de receptor geneticamente fundido com um indicador óptico fluorescente sensível ao pH (por exemplo, pHluorin)⁶. Por outro lado, essas abordagens são limitadas ou impraticáveis ao avaliar os níveis de receptores de superfície in vivo. Por exemplo, o procedimento de biotinilação de superfície pode não ser prático para processar grandes quantidades e números de amostras de tecidos cerebrais in vivo devido ao seu preço relativamente alto e às etapas subsequentes necessárias para purificar as proteínas biotiniladas em esferas conjugadas com avidina. Para neurônios embutidos na arquitetura tridimensional do cérebro, a baixa acessibilidade de anticorpos ou dificuldades na quantificação baseada em microscópio podem representar uma limitação significativa para avaliar os níveis de receptores de superfície in vivo. Para visualizar a distribuição dos receptores de neurotransmissores em cérebros intactos, métodos não invasivos, como a tomografia por emissão de pósitrons, poderiam ser usados para medir a ocupação do receptor e estimar os níveis de receptores de superfície⁷. No entanto, essa abordagem depende criticamente da disponibilidade de radioligantes específicos, equipamentos caros e conhecimentos especiais, tornando-a menos acessível para uso rotineiro pela maioria dos pesquisadores.

Aqui, descrevemos um método simples e versátil para medir os níveis de receptores de superfície em cérebros de animais experimentais ex vivo usando um reticulante químico solúvel em água, impermeável por membrana, bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3)^8,9. BS3 tem como alvo aminas primárias na cadeia lateral de resíduos de lisina e pode covalentemente reticular proteínas em estreita proximidade umas das outras. Quando fatias cerebrais são preparadas na hora a partir de uma região de interesse e incubadas em um tampão contendo BS3, os receptores de superfície celular são reticulados com proteínas vizinhas e, assim, transformam-se em espécies de maior peso molecular, enquanto os receptores intracelulares associados à endomembrana permanecem inalterados. Portanto, os pools de receptores intracelulares e de superfície podem ser separados por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE) e quantificados por western blot usando anticorpos específicos para o receptor a ser estudado.

O estresse crônico leve imprevisível (EMCU) é um paradigma experimental bem estabelecido para induzir estresse psicossocial crônico em roedores¹⁰. A SCMC provoca fenótipos comportamentais ansiosos/depressivos e déficits cognitivos por meio da modulação de uma série de sistemas de neurotransmissores, incluindo o GABA e seus receptores^10,11. Em particular, o receptor GABA A contendo a subunidade α5 (α5-GABA_A R) está implicado na regulação da memória e das funções cognitivas^12,13, sugerindo o possível envolvimento de funções alteradas dessa subunidade em déficits cognitivos induzidos pelo SGCU. Neste protocolo, usamos o ensaio de reticulação BS3 para quantificar os níveis de α5-GABA_AR expresso na superfície no córtex pré-frontal de camundongos expostos à EMCU em comparação com camundongos controles não estressados.