Анализ химического сшивания BS3: оценка влияния хронического стресса на клеточную поверхность Презентация рецептора ГАМКА в мозге грызунов
Summary
Анализ химического сшивания BS3 выявляет снижение экспрессии рецептораГАМК А на клеточной поверхности в мозге мыши в условиях хронического психосоциального стресса.
Abstract
Тревога — это состояние эмоций, которое по-разному влияет на поведение животных, включая когнитивные функции. Поведенческие признаки тревоги наблюдаются во всем животном мире и могут быть распознаны как адаптивные или неадаптивные реакции на широкий спектр модальностей стресса. Грызуны представляют собой проверенную экспериментальную модель для трансляционных исследований, посвященных интегративным механизмам тревоги на молекулярном, клеточном и схемном уровнях. В частности, парадигма хронического психосоциального стресса вызывает дезадаптивные реакции, имитирующие поведенческие фенотипы, похожие на тревогу / депрессию, которые аналогичны людям и грызунам. В то время как предыдущие исследования показывают значительное влияние хронического стресса на содержание нейротрансмиттеров в головном мозге, влияние стресса на уровни рецепторов нейротрансмиттеров недостаточно изучено. В этой статье мы представляем экспериментальный метод количественной оценки поверхностных уровней нейрональных рецепторов нейротрансмиттеров у мышей при хроническом стрессе, уделяя особое внимание рецепторам гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), которые участвуют в регуляции эмоций и познания. Используя мембранонепроницаемый необратимый химический сшивающий агент, бисульфосукцинимидилсуберат (BS3), мы показываем, что хронический стресс значительно снижает поверхностную доступность рецепторовГАМК А в префронтальной коре. Поверхностные уровни нейронов рецепторовГАМК А являются процессом, ограничивающим скорость нейротрансмиссии ГАМК, и, следовательно, могут использоваться в качестве молекулярного маркера или прокси степени тревожных/депрессивных фенотипов в экспериментальных моделях на животных. Этот подход к сшиванию применим к различным рецепторным системам для нейротрансмиттеров или нейромодуляторов, экспрессируемых в любой области мозга, и, как ожидается, будет способствовать более глубокому пониманию механизмов, лежащих в основе эмоций и познания.
Introduction
Рецепторы нейротрансмиттеров локализованы либо на поверхности плазматической мембраны нейронов, либо внутриклеточно на эндомембранах (например, эндосоме, эндоплазматическом ретикулуме [ER] или транс-аппарате Гольджи) и динамически перемещаются между этими двумя компартментами в зависимости от внутренних физиологических состояний нейронов или в ответ на активность внешней нейронной сети 1,2. Поскольку вновь секретируемые нейротрансмиттеры проявляют свои физиологические функции главным образом через локализованный на поверхности пул рецепторов, уровни поверхностных рецепторов для данного нейротрансмиттера являются одним из важнейших факторов, определяющих его сигнальную способность в нейронной цепи3.
Существует несколько методов мониторинга уровней поверхностных рецепторов в культивируемых нейронах, включая анализповерхностного биотинилирования 4, иммунофлуоресцентный анализ со специфическим антителом в непермеабилизированных условиях5 или использование трансгена рецептора, генетически слитого с pH-чувствительным флуоресцентным оптическим индикатором (например, pHluorin)6. Напротив, эти подходы либо ограничены, либо непрактичны при оценке уровней поверхностных рецепторов in vivo. Например, процедура поверхностного биотинилирования может быть непрактичной для обработки больших количеств и количества образцов тканей головного мозга in vivo из-за ее относительно высокой цены и последующих этапов, необходимых для очистки биотинилированных белков на конъюгированных с авидином шариках. Для нейронов, встроенных в трехмерную архитектуру мозга, низкая доступность антител или трудности с количественной оценкой на основе микроскопа могут представлять собой значительное ограничение для оценки уровней поверхностных рецепторов in vivo. Чтобы визуализировать распределение рецепторов нейротрансмиттеров в интактном мозге, неинвазивные методы, такие как позитронно-эмиссионная томография, могут быть использованы для измерения занятости рецепторов и оценки уровней поверхностных рецепторов7. Однако этот подход критически зависит от наличия конкретных радиолигандов, дорогостоящего оборудования и специальных знаний, что делает его менее доступным для повседневного использования большинством исследователей.
Здесь мы описываем простой, универсальный метод измерения уровней поверхностных рецепторов в мозге экспериментальных животных ex vivo с использованием водорастворимого, мембранонепроницаемого химического сшивающего агента, бис(сульфосукцинимидил)суберата (BS3)8,9. BS3 нацелен на первичные амины в боковой цепи остатков лизина и может ковалентно сшивать белки в непосредственной близости друг от друга. Когда срезы мозга свежеприготовлены из интересующей области и инкубированы в буфере, содержащем BS3, рецепторы клеточной поверхности сшиваются с соседними белками и, таким образом, превращаются в более высокомолекулярные виды, тогда как внутриклеточные эндомембранные рецепторы остаются немодифицированными. Таким образом, поверхностный и внутриклеточный пулы рецепторов могут быть разделены электрофорезом в виде додецилсульфата натрия и полиакриламидного геля (SDS-PAGE) и количественно определены вестерн-блоттингом с использованием антител, специфичных к исследуемому рецептору.
Непредсказуемый хронический умеренный стресс (UCMS) является хорошо зарекомендовавшей себя экспериментальной парадигмой для индуцирования хронического психосоциального стресса у грызунов10. UCMS вызывает тревожные/депрессивные поведенческие фенотипы и когнитивный дефицит посредством модуляции множества нейротрансмиттерных систем, включая ГАМК и ее рецепторы10,11. В частности, α5-субъединичный рецепторГАМК А (α5-ГАМКАR) участвует в регуляции памяти и когнитивных функций12,13, что позволяет предположить возможное участие измененных функций этой субъединицы в UCMS-индуцированном когнитивном дефиците. В этом протоколе мы использовали анализ сшивания BS3 для количественного определения уровней поверхностной экспрессии α5-ГАМКAR в префронтальной коре мышей, подвергшихся воздействию UCMS, по сравнению с контрольными мышами без стресса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя влияние хронического психосоциального стресса на поведение (т.е. эмоциональность и когнитивный дефицит) и молекулярные изменения (т.е. снижение экспрессии ГАМКергических генов и сопутствующий дефицит ГАМК-ергической нейротрансмиссии) хорошо задокументировано10, мех?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят персонал животноводческого центра CAMH за заботу о животных на протяжении всего исследования. Эта работа была поддержана Канадским институтом исследований в области здравоохранения (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), Фондом Discovery от CAMH (до T.P.), Национальным альянсом по исследованиям шизофрении и депрессии (награда NARSAD #25637 для E.S.) и Научно-исследовательским институтом психического здоровья семьи Кэмпбелл (для E.S.). E.S. является основателем Damona Pharmaceuticals, биофармацевтической компании, занимающейся внедрением новых ГАМКергических соединений в клинику.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E. Molecular origin of somatostatin-positive neuron vulnerability. Molecular Psychiatry. 27 (4), 2304-2314 (2022).
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
